内含肽及其应用姓名：刘郁倩学号：1043095030专业：轻工生物技术摘要：尽管内含肽对生物体内及蛋白质宿主本身的生物学功能目前所知甚少,但从其被发现至今短短的二十几年内,无论是在基础科学研究中还是在医学实践已经得到了广泛关注和应用。本文阐述了内含肽的定义、发现、分布、结构、核酸内切酶活性、剪接机制。介绍了内含肽的应用方式。并对内含肽的应用前景进行了展望。关键词：内含肽；核酸内切酶活性；剪接机制；应用1内含肽的基本概念1.1内含肽的定义内含肽，即蛋白质内含子，是存在于前体蛋白质中的一段氨基酸序列，在前体蛋白转变为成熟蛋白的过程中，它靠自我剪切的方式从前体蛋白中释放出来，同时两端的肽链以肽键的方式相连，该过程即为蛋白质剪接。蛋白质剪接不同于RNA剪接，前者的剪接发生在蛋白质水平，而后者的剪接发生在RNA水平；它也不同于蛋白质翻译后加工，后者往往只是切除前体蛋白N端或C端的一些片段，通常没有多肽链的形成；而且也不同于酶原活化，蛋白质剪接有新肽键的形成。与内含肽相对应的是蛋白质外显肽，即内含肽两侧的氨基酸序列。位于内含肽N端的序列称为N-外显肽，位于内含肽C端的序列称为C-外显肽。N-、C-外显肽在内含肽的作用下通过肽键连接成完整的成熟蛋白。内含肽有8种存在状态：剪接反应前称为融合内含肽，剪接反应后称为游离内含肽。两者的一级结构相同但功能却不同，前者可以自催化蛋白质前体的剪接反应，后者可作为归巢核酸内切酶参与内含肽归巢[1]。1.2内含肽的发现1990年Kane等在研究酵母液泡H+-ATPase的69kD(1D=1u=1.6605402×10-27kg)亚基基因vma1时首次发现蛋白质自我剪接现象。此后两个研究组又分别在海滨嗜热球菌的DNA聚合酶基因以及结核分支杆菌的recA基因中发现了类似情形。随后又陆续在多种生物中发现了蛋白质内含肽。截止2002年7月,共有136种蛋白质内含肽注册在http:PPwww.neb.comPnebPinteins.html.这些内含肽主要来源于古细菌、真细菌和真核细胞。其中真核细胞7种，真细菌中47种，古细菌中82种[2]。同时还发现蛋白质内含肽具有两种不同的酶活性，除了能够进行蛋白质自我剪接外，还可以介导DNA片段的转移，即具有归巢核酸内切酶活性。Guhan[3]等人最近的研究发现，结核分支杆菌的RecA内含肽含有一个新的ATP依赖的位点特异的双链DNA核酸内切酶活性。结核分支杆菌recA基因的开放阅读框架有一段插入序列，猜测可能编码核酸内切酶(PI2MtuI)，recA基因归巢到没有recA序列等位基因处必须要求这种内切酶活性。PI2MtuI结合双链和单链DNA的能力相同，但只有在辅助因子的作用下才能切开DNA链。值得注意的是，在有交替辅助因子作用下，PI2MtuI能够使超螺旋DNA出现缺口，但需要Mn2+和ATP产生线性双链DNA。这一结果表明RecA内含肽是一新的Mn2+-ATP依赖的双链位点特异核酸内切酶，它可能在归巢过程中起重要作用[4]。1.3内含肽的分布内含肽的分布广泛，生物三大系统中都存在内含肽，且在真核生物的细胞器和细胞核中都有分布。但同源比较发现真核生物的内含肽只存在于单细胞真核生物中，而在多细胞真核生物中未见报道。在182个内含肽中，古细菌占86个，真细菌76个，其余20个在真核生物中。可以明显地看出，内含肽在古细菌中比较丰富，真细菌次之，真核生物中最少，这一分布规律与RNA内含子相反，这在一定程度上说明了内含肽的分布在种属上有一定差异。另外，50%以上的内含肽是分布在与DNA复制、修复、转录和翻译有关的酶或蛋白质中，少数在谷胺酰果糖-6-磷酸转氨酶和液泡三磷酸腺苷酶等代谢酶中，这说明内含肽分布在蛋白质种类间有一定差异。1.4内含肽的结构大部分内含肽由两端的剪切区域和中间的核酸内切酶结构域或连接结构域组成。根据这一特征,内含肽可分为3种:经典内含肽、微小内含肽和断裂型内含肽。经典内含肽和微小内含肽均包含两端的剪接结构域和中间区域,不同的是,前者中间区域为核酸内切酶结构域,而后者为连接结构域,不同微小内含肽连接结构域的长度并不相同。断裂型内含肽的中间区域在特定位点断开,形成N端片段(IN)和C端片段(IC),而且分别位于基因组上相距较远的2个基因上,在前体蛋白翻译成熟过程中,这2个片段相互识别并恢复核酸内切酶活性,介导蛋白质反式剪切。序列分析表明,内含肽由10个模块组成。从内含肽N端开始依次为A、N2、B、N4、C、D、E、H、F和G,其中A、N2、B、N4为N端剪切区域,F、G为C端剪接区域,C、D、E、H为自导引核酸内切酶活性区域或连接结构域。Perler等对内含肽序列的进一步分析表明,参与内含肽剪接的基序A、B、F、G在剪接位点处的氨基酸残