信号肽在基因工程的应用信号肽：常指新合成多肽链中用于指导蛋白质的跨膜转移（定位）的N-末端的氨基酸序列。（有时不一定在N-末端）信号肽位于分泌蛋白的N端。一般由15～30个氨基酸组成。包括三个区：一个带正电的N末端，称为碱性氨基末端：一个中间疏水序列．以中性氨基酸为主，能够形成一段d螺旋结构，它是信号肽的主要功能区；一个较长的带负电荷的C末端，含小分子氨基酸，是信号序列切割位点．也称加工区。信号肽的结构特点前端（Ns端）：介于-1～+5之间，均带正电荷的碱性aa残基作用：可能和信号肽序列受体（SSR）结合有关。中部(Hs区域)：12～14个aa残基组成疏水片段Met.Leu.Phe。作用：1）高度疏水，倾向于α—螺旋。有利于与脂质双层作用，促进新生肽链过膜。2）Hs与信号序列识别颗粒（SRP）结合有关(SPR将新生肽链核糖体和RER膜靠近)后端（Cs1,Cs2）：富含A/a，易形成β—折叠，有利于肽链断裂。作用：是位于RER膜上的信号肽酶复合物（SPC）水解部位，切除信号肽，使新生肽链也能进入RER。注意：1）信号肽的疏水片段较重要，因为如果利用点突变将其中心的疏水aa换成亲水aa，信号肽的功能丧失。2）信号肽不一定位于分泌蛋白的N端。例如：真核细胞的卵清蛋白N端26～45个aa可能具有信号肽作用，这样的信号肽称为内含信号肽。3）有些比较复杂的膜蛋白（如视蛋白Opsin）可以含有一个以上的信号肽，这些信号肽不一定会被水解。信号肽分泌蛋白的转运过程分泌型表达载体----基因工程技术与应用分泌型表达载体分泌型表达载体——原核原核常用的信号肽：碱性磷酸酶的信号肽和蛋白质A的信号肽pTA1529----phoA(碱性磷酸酶)pINⅢ系统----ompa（外膜蛋白)PEZZ18----蛋白ApTA1529大肠杆菌phoA（碱性磷酸酶）启动子和信号肽序列。外源基因插入到信号肽序列后的酶切位点。在磷酸盐饥饿时，外源蛋白表达。由周质信号肽酶切下信号肽。pINIII系统D下游，编码信号肽，可引导蛋白跨膜2、优点：分泌表达，避免降解。pEZZ18Plac：Lac启动子Pspa：金黄色葡萄球菌蛋白A启动子S：蛋白A的信号肽序列两个合成的Z功能域（结合lgG，琼脂糖层析柱）2分泌型表达载体——真核酵母常用信号肽序列：α因子、酸性磷酸酶（PHO5)、蔗糖酶（SUC2）等的信号肽。α因子信号肽包含83个氨基酸的前导肽及后面的一段由Lys-Arg(Glu-Ala)l-2或Lys-Arg-Glu-Ala-Asp-Ala氨基酸序列组成的问隔肽。膜结合蛋白酶KEX2基因产物识别Lys-ArgC端，STEl3基因产物则识别(Glu-Ala)l一2或Asp-Ala外侧。常用的分泌表达载体有：pPIC9K、pPICZα、pGAPZα系列——α因子分泌型表达载体——真核PGAP甘油醛三磷酸脱氢酶启动子：组成型表达启动子新型毕赤酵母分泌表达载体的构建与功能验证毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2的构建BglⅡ酶切构建好的2种新型毕赤酵母表达载体pGAPHα-xyn2和pGAPHI-xyn2，使质粒线性化，电击法转化毕赤酵母GS115，筛选转化子。在培养基中震荡培养48h，离心取上上清液，测定木聚糖酶活性，以毕赤酵母诱导型表达载体pPIC9-xyn2为对照，实验结果如表：融合gp67信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基因在蚕体内表达2.3.血淋巴中表达产物含量的测定表达产物经SDS-PAGE电泳,脱色后用凝胶干燥仪干燥,用Bio-RadGS-670图像分析仪进行扫描处理。测得CrBK-API4感染的血淋巴上清液中表达的API占可溶性蛋白含量的9%,CrBK-gpAPI2感染的血淋巴上清液中表达的API占可溶性蛋白含量的7%。血淋巴中可溶性蛋白总量测定表明:CrBK-API4感染的血淋巴上清液中为40mg/mL,CrBK-gpAPI2感染的血淋巴上清液中为55mg/mL。从而得到血淋巴中表达的慈菇蛋白酶抑制剂的绝对含量:CrBK-API4感染的血淋巴中为3.6mg/mL,CrBK-gpAPI2感染的血淋巴中为3.8mg/mL。两者的绝对表达量差别不大。4.表达的慈菇蛋白酶抑制剂的活性测定水稻条纹病毒CP与叶绿体RubiscoSSU引导肽融合基因的构建及其原核表达方法1.叶片总RNA的提取2.PCR扩增RubiscoSSU和RSVCP基因3.pMD-R和pMD-CP克隆载体的构建4.pGEX-PR和pET-PR-S表达载体的构建5.PR-CP和PR-S-CP融合基因的构建6.融合基因在大肠杆菌中的表达7.表达产物的Westernblot鉴定参考资料：融合gp67信号肽的慈菇蛋白酶抑制剂基