一、检测蛋白质与蛋白质相互作用①ＦREＴ技术(invｉvo)FRET，Fluoresｃenceｒesonancｅenergytransfer，即荧光共振能量转移技术。该技术得原理就是用一种波长得光激发某种荧光蛋白后,它释放得荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白,使其释放另一波长得荧光,如下图所示:以下图为例,若要利用FＲET检测两种蛋白就是否有相互作用,需将两种蛋白得基因分别与这两种荧光蛋白得基因融合,并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFＰ进行激发，并检测GＦP就是否放出绿色荧光.如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用;反之,则就是这两种蛋白没有相互作用。②酵母双、三杂交技术(invivｏ)酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白就是否有相互作用,其原理就是典型得真核生长转录因子,如GＡL4、GＣN4等都含有二个不同得结构域，即ＡD与BD.这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录．由此,设计不同得两个载体,一个含有AD基因（假设为A载体),另一个含有BD基因(假设为Ｂ载体）。一般将一个已知蛋白得基因连在Ｂ载体上，作为诱饵（Baｉt),将未知蛋白得基因连在A载体上,将这两个载体都转到特定得酵母细胞内,瞧未知蛋白与已知蛋白就是否有相互作用.如果两者有相互作用,那么就可以启动报告基因得转录,从而使这个酵母细胞能在选择培养基上显现出来或者生存下来;如果两者无相互作用，那么报告基因就无法表达,那么这个酵母细胞就无法在择培养基上显现出来或者生存下来，如下图所示:由于酵母双杂交系统不能鉴定膜蛋白间得相互作用，因此又发展出了分离泛素酵母双杂交系统。该系统得原理如下图所示:如图所示，将泛素蛋白拆分为两个片段,即C端段（Ｃub)与Ｎ端段(NubG）,并在Ｃ端段得Ｎ端接上一个LｅxA—VP16转录因子,此时它并不能激活基因转录(因为它被限制在了C端段上，不能进入细胞核发挥作用）。将该C端段连到一个膜蛋白上,将N端段连接到另一个膜蛋白上。若两个膜蛋白有相互作用,那么两个膜蛋白在相互靠近时会使泛素蛋白得Ｎ端段与C端段靠近结合,形成一个完整得泛素蛋白。此时泛素蛋白酶体会将这一段被泛素标记得片段降解，那么连接C端段得LexA-VＰ16转录因子掉落，即可进入细胞核启动标记基因得表达。酵母三杂交得原理与双杂交一样,只就是它研究得就是两个蛋白与第三个成分间得相互作用,通过第三个成分使两个蛋白相互靠近。第三个成分可以就是:蛋白、RNＡ或小分子,如下图所示:如上图所示,在加入第三种成分前，蛋白X与蛋白Y之间并无直接相互作用,因此无法使BD与AD靠近,报告基因不能表达;当加入第三种成分后,蛋白X与蛋白Y得距离被拉近,ＢD与AＤ靠近,报告基因表达,从而可以被检测到。③Puｌlｄoｗn技术(iｎｖｉｔro)Ｐuｌlｄｏwn，即蛋白沉降技术,它就是建立在蛋白质亲与层析得基础上得一种检测蛋白质间相互作用得分析方法．亲与层析得原理如下图所示,不同蛋白对配体得亲与程度不同,因此可以先将非特异结合得蛋白用低浓度缓冲液给清洗出去,只剩目得蛋白与层析柱结合,然后再用洗脱液将目得蛋白洗脱下来,达到纯化目得蛋白得作用。Puｌldown技术利用得就是亲与层析技术以及特异得配体(如GSH或者镍）。以下图为例,将ＧSＴ得基因与蛋白X得基因融合,表达出融合蛋白。将该融合蛋白得溶液过带有GSH配体得层析柱,那么这一融合蛋白就能结合在配体上,然后将待测蛋白得溶液过柱,并让其与融合蛋白反应一段时间。接着开始进行洗脱.如果待测蛋白与蛋白X无相互作用,那么在开始清洗得时候就会被洗下来；如果在用洗脱液洗脱后才能在收集到得样品中发现待测蛋白(以及蛋白X)，说明待测蛋白与蛋白X可能有相互作用。④Faｒwesterｎbloｔ（invitｒo）Ｆａrwesternｂlot就是基于ｗesterｎblot发展而来,其原理如下图所示.将样品蛋白用非变性得ＰAＧE胶分离，然后转膜、封闭、洗膜,加入待测蛋白，使其与已在膜上得样品蛋白进行相互作用．接着加入带有标记（如HRP)得待测蛋白得抗体反应，最后进行显色（如加入HRP得底物），观察实验结果。⑤免疫共沉淀（Co—ＩP）（invivo)免疫共沉淀就是探测活体细胞内蛋白间得相互作用得一门技术.它得原理就是当细胞在非变性条件下被裂解时,完整细胞内存在得许多蛋白质-蛋白质间得相互作用被保留了下来。如果用蛋白Ｘ得抗体免疫沉淀Ｘ,那么与X在体内有相互作用得蛋白Y也能沉淀下来。Ｃｏ—ＩP得原理如下图所示,首先从细胞中提取蛋白质,获得蛋白提取液,并将其与抗体孵育,使抗体与蛋白X结合。将预处理过得ｐroteiｎG琼脂糖珠(Sepharose）加入到抗体与蛋白提取液得孵育液中反应,使抗体与prｏteinG结