《免疫学》实验教学指导书生物与食品工程学院2013-05-31实验一玻片凝集实验细菌细胞或红细胞等颗粒性抗原与特异性抗体结合后，在有电解质的情况下，会出现肉眼可以看见的凝集块，称为凝集反应。这类反应较简单、迅速，常用于抗原或抗体的定性检测。例如细菌的鉴定、分型及ABO血型鉴定。这里介绍人类的ABO血型鉴定方法。1.原理ABO血型系统是按照血液中红细胞表面的抗原分子来命名的。人类ABO血型抗原有两种:A抗原和B抗原。A型血红细胞表面有A抗原，B型血红细胞表面有B抗原，AB型血红细胞表面有A、B两种抗原，若红细胞表面无这两种抗原，则为O型血。若用已知的抗A血清和抗B血清与受试者红细胞上的相应抗原结合，即可能引起红细胞凝集，据凝集状况便可判定出受试者的血型。2.材料（1）标准抗A血清、抗B血清。（2）玻片、75%酒精、碘酒、无菌三棱采血针、灭菌火材棒、无菌棉签。3.方法（1）取洁净载玻片1张，用蜡笔分为2格，注明A、B字样。（2）倒置标准抗血清试剂瓶，悬空轻挤出抗A血清1滴，滴加在A格内；同法在B格内加抗B血清1滴。（3）消毒左手无名指指尖，待酒精自然干燥后，用无菌采血针快速刺破皮肤。（4）用木棒的两端取血，分别在抗A血清和抗B血清中搅拌混匀。（5）无菌干棉球压迫手指止血。（6）静置玻片数分钟，在白色背景下观察凝集结果。4.结果判断混合液由红色均匀浑浊逐渐变为透明，并出现大小不等的红色凝集块者，为红细胞凝集。混合液仍呈均匀浑浊，则未发生凝集。根据结果可判断血型。5.注意事项（1）载玻片标明A、B，不要让两种抗血清混合。（2）采血前要消毒手指，在酒精干燥前不要采血，以免酒精破坏红细胞。（3）木棒的两端不可混用。（4）及时观察结果。（5）对被血液污染的用品在废弃前，要定点放置，集中进行严格的消毒，以防传播疾病。例如，沾血的载玻片浸泡在84消毒液中，木棒、采血针、棉球要高压处理。6.作业与思考（1）按表1上报实验结果。表1血型的判断血型抗血清ABABO抗A血清+-+-抗B血清-++-（2）何为凝集实验？实验二试管凝集实验颗粒性抗原(细菌、螺旋体、红细胞等)与相应抗体结合后，在有适量电解质存在下，抗原颗粒可相互凝集成肉眼可见的凝集块，称为凝集反应(Agglutinationreaction)或凝集试验。参与凝集反应的抗原称为凝集原（Agglutinogen），抗体称为凝集素（Agglutinin）。凝集反应包括直接凝集反应和间接凝集反应两大类，本实验主要介绍直接凝集反应（试管法）。1.原理此次实验是以定量的牛布氏杆菌为抗原，根据是否发生凝集反应，来检测血清中是否含有对应的抗体；并根据各管凝集程度的不同，来判断抗体的效价。2.材料（1）试管（1cmx8cm），试管架，微量可调加样器，吸头（tip头），记号笔。（2）灭菌的0.5%石炭酸生理盐水。（3）布氏杆菌病试管凝集抗原，布氏杆菌病阳性血清，布氏杆菌病阴性血清，被检血清（牛）。3.方法:（1）试管准备：每份血清用试管4支，另取3支试管作为对照，作好标记，置试管架上。如被检血清有多份，对照只需做1份。（2）被检血清稀释：第1管加入2.3ml0.5%石炭酸生理盐水，第2、3、4管加入0.5ml0.5%石炭酸生理盐水；然后用加样器或刻度吸管吸取被检血清0.2ml，加入第1管中，反复吹吸5次混匀，吸取1.5ml弃之，再吸取0.5ml加入第2管中，混匀后吸取0.5ml加入第3管，依此类推至第4管，混匀后吸弃0.5ml（见表1-1）。该被检血清的稀释度分别是1:12.5、1:25、1:50、1:100。（3）对照管制作：第5管中加0.5%石炭酸生理盐水0.5ml，第6管加1:25稀释的布氏杆菌病阳性血清0.5ml，第7管加1:25稀释的布氏杆菌病阴性血清0.5ml。（4）加抗原：将布氏杆菌病试管凝集抗原用0.5%石炭酸生理盐水作1:20稀释，每支试管加0.5ml。表1-1布氏杆菌病试管凝集试验术式表（单位：ml）试管号1234567对照管最终血清稀释度1：12.51：251：501：100抗原阳性血清阴性血清1：251：250.5%石炭酸生理盐水2.30.50.50.50.5被检血清0.20.50.50.50.50.5抗原(1：20)0.50.50.50.50.50.50.5弃1.5弃0.5（5）感作（反应）：7支试管加完抗原后，充分混匀，置于37℃温箱中24h，然后观察并记录结果。（6）结果判定：判定结果时用“+”表示反应的强度。根据各管中上清液的透明度、抗原被凝集的程度及凝集块的形状，来判定凝集反应的程度。＋＋＋＋：100％抗原凝集，上清液完