体细胞克隆技术的原理及过程胡钟星（生物工程四班20104524）内容提要：体细胞克隆技术是指把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态。采用核移植的方法，利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育过程，妊娠产仔，克隆出动物的技术，又可称之为体细胞核移植技术。比如克隆绵羊“多利”，它是利用细胞拆和技术将成熟母绵羊乳腺细胞核取出并导入到另一只母绵羊的去核卵细胞，再将这个基因已被“调包”的卵细胞放电激活，使其开始像正常的受精卵那样进行细胞分裂；当细胞分裂进行一定连阶段、胚胎已经形成后，再将这个胚胎植到第三只母绵羊，经过正常的妊娠后产下“多利”。关键词：体细胞克隆、核移植技术、克隆原理、乳腺上皮细胞、山羊正文：一、概述：克隆是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。动物克隆方法主要有两种，一是胚胎分割；二是细胞核移植。胚胎分割技术克隆胚胎一次只能得到1-4个克隆，因此潜力有限。细胞核移植技术是动物克隆的主要手段，通常所说动物克隆技术是指动物细胞核移植克隆动物的技术。用于核移植的动物细胞又分两种，一是来自早期胚胎，即胚胎细胞；二是来自成体动物的各种组织，即体细胞。体细胞克隆技术是指把动物体细胞经过抑制培养，使细胞处于休眠状态。采用核移植的方法，利用细胞拆合或细胞重组技术，将卵母细胞去核作为核受体，以体细胞或含少量细胞质的细胞核即核质体作为核供体，将后者移入前者中，构建重组胚，供体核在去核卵母细胞的胞质中重新编程，并启动卵裂，开始胚胎发育过程，妊娠产仔，克隆出动物的技术。二、原理：动物克隆技术所依靠的理论基础是细胞潜在全能性。所说的细胞的全能性是指细胞包含个体的全套遗传信息，在特定环境因素的调节下，可回到受精卵一样的状态，从头开始发育成一个完整的生物个体，只有具备全能性的动物组织细胞，才可用于克隆动物。对于体细胞克隆来说，在细胞分化过程中，细胞核全能性的潜能受到限制。虽然细胞核内的DNA序列没有改变，但基因在特定的细胞内所表达的蛋白质成分有限。这主要是因为染色体组织改变和稳定阻遏核蛋白复合体阻遏以及相应转录激活的缘故。因此有效的核移植供体核必须像正常受精卵细胞核一样进行细胞周期活动，才能发育成新个体，那么作为受体的细胞质就要求必须有再程序化供体核的能力。三、过程：动物克隆技术主要包含以下几个步骤：动物克隆技术的核心是核移植。核供体动物的选择与细胞核的获得。核受体动物的选择与细胞核的移出。供体核的移入及原核的取出。胚泡的体外试管培养。代母的选择与胚泡移入子宫。克隆动物的体内发育与出生。下面以转染乳腺上皮细胞为供核细胞制备克隆羊为例描述克隆动物的产生。1材料与方法1.1化学试剂与实验材料DMEM/F12购自Gibco公司;FCS购自Hyclone公司;电转染液(HypoosmolarBuffer)购自eppendorf公司;FSH,LHRH和PG购自宁波激素厂;其他试剂除特殊说明外,均购自Sigma公司;实验羊购自徐州地区。1.2hLF表达载体转染乳腺上皮细胞1.2.1乳腺上皮细胞的培养无菌手术切取大约5g左右的泌乳期(第5天)山羊乳腺实质组织,将腺泡组织剪成约1mm3大小,用I型胶原酶消化液(含I型胶原酶200IU/mL,透明质酸酶100IU/mL)振荡消化1.5h,收集悬液离心后,用D-hank’s离心洗涤3次,细胞计数并用培养液(含DMEM/F12,10%FCS,乙酸钠5mmol/L,转铁蛋白5μg/mL,乙醇胺0.5mmol/L,胰岛素10μg/mL,氢化可的松5μg/mL)调整密度至4×105个/mL接种于六孔板中,置CO2培养箱中,37oC、5%CO2、饱和湿度下静置培养。根据成纤维细胞对消化液敏感性不同,贴壁生长的细胞用0.05%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化3min后,弃去含脱壁成纤维细胞的消化液,重新加入培养液培养,传代重复3次可获得较纯的乳腺上皮细胞。1.2.2细胞转染、筛选用SalI和NotI双酶切pBLC-14质粒(本室保存)获得线性化hLF乳腺特异性表达载体(图1),经QIAEX试剂盒回收后溶于超纯水中,−20oC保存。收集对数期乳腺上皮细胞,用电转染液洗涤离心后重悬细胞密度至1×106个/mL,加入DNA使终浓度为10μg/mL,以2.0kV/cm、100μs的条件电击1次,48h后加入400μg/mLG418筛选,每2天换1次液,14d后挑取克隆细胞以200μg/mLG418筛