目录目录1TheBasicTechnologiesforDNAManipulations目录2NucleicAcidBlottingandMolecularHybridization目录3?核酸分子杂交nucleotidemolecularhybridization–以DNA的变性、复性为理论基础–指具有一定同源序列的两条核酸单链DNA或RNA在一定条件下按碱基互补配对原则经过复性处理后形成异源双链的过程目录4Southern?由E.M.Southern在1975年提出?可用于分析基因拷贝数的变化?基本操作过程包括–待测DNA样品的制备和基因探针的标记–待测DNA样品的电泳分离–电泳分离的DNA经变性、转移、固定到合适的固相支持物–特异性核酸探针与膜上DNA片段杂交放射自显影或显色检测目的DNA的存在。目录5Southern滤纸NC膜凝胶滤纸电泳转移杂交显影酶切DNA样品上样DNA印迹重物缓冲液目录6NorthernRT-PCR?Northernblot是将RNA从凝胶中转印到硝酸纤维素膜上定性分析mRNA的常用方法?RT-PCR是以mRNA为模板反转录合成cDNA、再以cDNA为模板进行特异性扩增进行RNA定性或定量分析的一种方法?二者均可用于分析基因转录水平的变化。目录7?原位杂交insituhybridizationISH即利用分子杂交技术来进行基因及其表达产物定位分析的一种技术?可用于基因及其表达产物的定位分析。目录8一利用原位杂交技术进行基因定位分析?荧光原位杂交fluorescenceinsituhybridizationFISH?基因组原位杂交genomeinsituhybridizationGISH目录9FISH目录10二利用原位杂交技术确定特定基因的表达定位?RNA原位杂交?整体原位杂交WholemountinsituhybridizationWISH目录11PolymeraseChainReaction目录12?聚合酶链式反应polymerasechainreactionPCR–是一种在体外特异地扩增已知基因的方法–由K.Mullis于1983年建立–可用于分析基因及其产物的水平变化–可进行实时、定量分析–可结合免疫沉淀的方法确定蛋白质与DNA序列的相互作用。目录13PCR5335533555变性、退火引物533555dNTPsTaqDNA聚合酶不同长度新链DNA循环1引物变性、退火目录142530次循环后模板DNA得到扩增5335533553355335dNTPTaqDNA聚合酶均一长度新链DNA循环2目录15PCR?反转录PCRreversetranscriptionPCRRT-PCR是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术。?RT-PCR是目前从组织或细胞中获得目的基因以及对已知序列的RNA进行定性及半定量分析的最有效方法。目录16mRNA5AAAAAAn3mRNA5AAAAAAn3TTTTTTn5mRNA5cDNA3AAAAAAn3TTTTTTn5AAAAAAn3TTTTTTn5oligodT12-18反转录酶RNaseHDNA聚合酶S1核酸酶3cDNATTTTTTn5AAAAAAn3TTTTTTn5cDNA目录17PCRR3355上游引物下游引物荧光标记引物R33557版目录18PCRDNA7版目录19DNADNASequencing目录20DNA?20世纪70年代–双脱氧链终止法F.Sanger–化学裂解法A.Maxam和W.Gilbert?20世纪80年代–PCR及自动测序技术目录21?一Sanger双脱氧链终止法利用2′3′-双脱氧核苷酸掺入中?二Maxam-Gilbert化学裂解法利用化学试剂裂解修饰碱基止聚合反应目录227版目录237版GATC测序反应电泳AACGTGGACTAACGTGGACAACGTGGAAACGTGGAACGTGAACGTAACGAACAAA53正极负极ddGddAddTddC目录24DNAddG红ddTddA绿ddC蓝橙毛细管电泳荧光标记DNA合成测序结果展示目录25DNA?通过DNA序列分析可以鉴定基因和基因组的变异?通过DNA序列测定分析人工重组的基因?通过DNA序列测定对定点突变进行确认目录26DNADNAChipTechnologies目录27DNA?DNA芯片DNAchip–在固相支持物上有序固化寡核苷酸或DNA探针与待测荧光标记样品进行杂交–通过对杂交信号的检测、比较和分析得出样品的遗传信息基因序列及表达–亦被称作DNA微阵列DNAmicroarray。目录287版目录29DNA?cDNA芯片每个探针是cDNA片段或基因的一段PCR产物可以同任何具有同源序列的样品形成杂交体同时定量监测大量基因的表达。?寡核苷酸芯片利用基因特异的寡核苷酸片段