情境一：分离纯化和选育生产菌种发酵工艺技术教材项目2保藏微生物菌种操作◆学习目标1.了解各种菌种保藏的基本原理和优缺点；2.学会根据菌种的特点选择相应的保藏方法；学会采用不同方法进行保藏菌种操作。菌种是从事微生物学以及生命科学研究的基本材料，特别是利用微生物进行有关生产，如抗生素、氨基酸、酿造等工业，更离不开菌种。所以菌种保藏是进行微生物学研究和微生物育种工作的重要组成部分。其任务首先是使菌种不死亡，同时还要尽可能设法把菌种的优良特性保持下来而不致向坏的方面转化。当然保藏菌种使其不变异亦是相对而言的。实际上没有一种方法可使菌种绝对不变化，所以研究菌种保藏就是要采用最合适的保存方法，使菌种的变异和死亡减少到最低限度。菌种是国家的重要资源，世界各国对这项资源都给予极大重视，很早就设置了各种专业性的保存机构，如ATCC、NRRL等。1980年我国成立了中国微生物菌种保藏委员会。1基础知识菌种保藏主要是根据菌种的生理生化特点，人工创造条件，使孢子或菌体的生长代谢活动尽量降低，以减少其变异。一般可通过保持培养基营养成分在最低水平、缺氧状态、干燥和低温，使菌种处于“休眠”状态，抑制其繁殖能力。一种好的保藏方法，首先应能长期保持菌种原有的优良性状不变，同时还需考虑到方法本身的简便和经济，以便生产上能推广使用。菌种保藏的方法很多，但其基本原理是大同小异的，主要是使微生物处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是低温、干燥、缺氧三方面，并尽量减少传代的次数，使菌株尽可能少发生突变，以达到保持纯种的目的。常用保藏法包括斜面传代保藏法、穿刺保藏法、液体石蜡保藏法、甘油管保藏法、沙土管保藏法、冷冻真空干燥保藏法等。由于这些保藏方法通常不需要特殊实验设备，操作简便易行，故为一般实验室及生产单位所广泛采用。斜面传代保藏法和穿刺保藏法是将在斜面或半固体培养基上已生长好的培养物置于4～5℃冰箱中保藏，并定期移植。这两种方法都是利用低温抑制微生物的生长繁殖，从而延长保藏时间。液体石蜡保藏法是在新鲜的斜面培养物上，覆盖一层已灭菌的液体石蜡，再置于4～5℃冰箱保存。液体石蜡主要起隔绝空气作用，使外界空气不与培养物直接接触，从而降低对微生物氧的供应量。培养物上面的液体石蜡层也能减少培养基水分的蒸发。故此法是利用缺氧及低温双重抑制微生物生长，从而延长保藏时间。甘油管保藏法是在液体的新鲜培养物中加入15％已灭菌的甘油，然后再置于－20℃或－70℃冰箱中保藏。此法是利用甘油作为保护剂，甘油透入细胞后，能强烈降低细胞的脱水作用，而且在－20℃或－70℃条件下，可大大降低细胞代谢水平，但却仍能维持生命活动状态，达到延长保藏时间的目的。沙土管保藏法是将待保藏菌种接种于适当的斜面培养基上，经培养后，制成孢子悬液，无菌操作将孢子悬液滴入已灭菌的沙土管中，孢子将吸附在沙子上，将沙土管置于真空干燥器中，通过抽真空达到吸干沙土管中水分，然后将干燥器置于4℃冰箱中保存。此法利用干燥、缺氧、缺乏营养、低温等因素综合抑制微生物生长繁殖，从而延长保藏时间。冷冻真空干燥保藏法集中了菌种保藏的有利条件，如低温、缺氧、干燥和添加保护剂。此法包括三个步骤：首先将待保藏菌种的细胞或孢子菌悬液悬浮于保护剂（如脱脂牛奶）中，目的是减少因冷冻或水分不断升华对微生物所造成的损害；继而在低温下（－70℃左右）使微生物细胞快速冷冻；然后在真空条件下使冰升华，以除去大部分水分。冷冻真空干燥保藏法是目前最有效的菌种保藏方法之一。它的优点是：适用范围广，保藏期长，存活率高。据报道，除少数不产生孢子只产生菌丝体的丝状真菌不宜采用此法保藏外，其他各大类微生物如细菌、放线菌、酵母菌、丝状真菌以及病毒都可采用此法保藏；而且采用此法保藏的菌种其保藏期一般可长达数年至十几年，均能取得良好保藏效果。缺点是设备昂贵，操作复杂。2材料、仪器设备和工具的准备2.1菌种：细菌、酵母菌、放线菌和霉菌斜面菌种。2.2培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，麦芽汁培养基，高氏1号培养基，马铃薯蔗糖培养基。2.3试剂：液体石蜡，P2O5或CaCl2，脱脂奶粉，10％HCl，干冰，95％乙醇，无菌水，甘油，食盐，河沙，瘦黄土(有机物含量少的黄土)。2.4器材：无菌试管，无菌吸管(1mL及5mL)，无菌滴管，甘油管，接种环，接种针，40目及100目筛子，干燥器，安瓿管，冰箱，冷冻真空干燥装置，酒精喷灯，三角烧瓶(250mL)，超净工作台，恒温培养箱，高压蒸汽灭菌锅。3操作实例3.1操作项目3.1.1斜面传代保藏操作⑴接种取各种无菌斜面试管数支，将注有菌株名称和接种日期的标签贴上，贴在试管斜面的正上方，距试管口2～3cm处。将待保藏的菌种用接种环以无菌操作法移接至相应的试管斜面上，细菌