第七章植物花药和花粉培养植物单倍体培养方法:植物花药/花粉培养历史概念：花药或花粉培养的作用：植株不受显隐性的影响，在诱变育种中能在当代及时获得突变个体，加倍后成为稳定的纯系。2、物种进化研究可探索亲本染色体组的构成。分析单倍体植物减数分裂时，形成二价体的数目和形状，能确定染色体组内是否存在同源染色体。3、遗传分析单倍体植株中基因不受显隐性的影响，每一个基因的作用均能表现出来。能用来研究基因的性质及其作用。还可用于基因的剂量效应分析。4、构建连锁图谱双单倍体（DH）群体是永久性群体，能有效地用于遗传图谱的构建5、用于遗传转化能直接表达外源基因，不受显隐性影响花粉孢子体发育途径（雄核发育）一、花粉发育的阶段二、雄核发育途径1、雄核发育与P花粉的形成P-花粉：具胚胎发生潜能的花粉。也称小花粉（S-花粉）或不染色花粉（NS-花粉）2、雄核发育与饥饿处理饥饿处理改变了小孢子的配子体发育方向，启动雄核发育。胚状体发育途径通过胚状体途径再生形成小植株胚状体发育途径愈伤组织发育途径愈伤组织转接种到再生培养基花药和花粉培养方法一、花药培养二、花粉培养梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）(二)花粉培养方式1、平板培养花粉置琼脂固化培养基上培养。2、液体培养花粉悬浮在液体培养基中培养，需震荡，以利通气。3、双层培养花粉置固体-液体双层培养基上培养。培养基制作方法：先铺一层琼脂固体培养基，凝固后，在表面加入少量液体培养基。4、看护培养利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。5、微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养6、条件培养基培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。看护培养图解三、白化苗现象（一）白化苗产生的影响因素及机理1、内因供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2、外因预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3、机理核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外地、无性系变异也可能是原因之一。（二）白化苗的控制通过对花粉发育时期、预处理、培养基成分等因素进行调控。四、影响雄核发育和花粉花药培养的因素芸苔属植物Brassicanapus不同基因型的小孢子产胚率比较（二）供体植株生长条件和生理状态1、植株生长条件光温等因素均能影响花药培养力。一般处于适宜生长条件（如温室中）较好。但物种间存在差异。2、植株生长时期一般是开花始期优于开花末期。3、P花粉的频率不同温度、日照时数、氮饥饿及生长物质处理提高P花粉的数量（三）花粉发育时期小孢子发育时期对诱导雄核发育非常重要。四分体:醋酸洋红染色单核晚期一般而言，单核期（第一次有丝分裂前）对诱导反应最敏感，为最佳培养期。不同物种诱导胚胎发生的最佳小孢子发育时期对不同发育阶段的花药进行培养测试确定最佳小孢子发育时期的形态特征注意形态特征会因品种、发育状态、环境条件的变化而发生变化（四）预处理预处理是小孢子培养成功的前提条件预处理目的：是改变小孢子的发育方向，使尽可能多的小孢子从配子体发育途径转向孢子体发育途径（即成为具胚胎发生潜力的小孢子）。适当的预处理能使绿苗产量大量增加。预处理方法：主要是对花药进行适度的逆境处理，包括低温、高温、化学物质、离心、射线等。1、高低温处理低温预处理：指在接种之前将材料用0℃以上低温处理一段时间后再接种。应用较多。处理温度一般在1-14℃，时间从几小时至几十天不等。不同作物所用的预处理温度及时间差异较大。不同的处理温度需要不同的时间。例子:小麦穗子培养前4℃预处理几天，花药培养效率显著提高。十字花科未经低温预处理的花蕾，每花药产胚数为4.39个，6-9℃处理1天，产胚数提高到61.4个，预处理4天后，胚状体产量降为10.47个。高温处理（热击处理）：指花药接种后，先在较高温度下（30-35℃）培养数天，然后再移至正常温度下继续培养。例子:如烟草，32℃高温；小麦，33℃高温预处理显著地提高了小孢子胚胎发生能力（Touraev，1996）2、化学物质处理（五）培养基2.碳源包括蔗糖、麦芽糖、纤维二糖、葡萄糖、果糖、海藻糖等。不同作物所需最适的碳源种类及浓度的所差异。一般认为单子叶植物比双子叶植物需糖的浓度要高。玉米中蔗糖效果最好；而麦类作物中，麦芽糖似乎为最好的碳源。3、激素4、氨基酸5、活性碳6、pH（六）培养条件（七）花药壁因素花药组织的存在对小孢子的胚性分裂具有明显的促进作用。但花药壁损伤会释放有毒物质影响小雄核的发育。单倍体植株鉴定和染色体加倍一、倍性鉴定（为什么要进行倍性鉴定？）（4）杂交鉴定法自交或测交鉴定