植物花药和花粉培养花药和花粉培养：指在合成培养基上，改变花粉的发育途径，使其不形成配子，而像体细胞一样进行分裂、分化、最终发育成完整植株。该发育途径被称为“花粉孢子体发育途径”或“雄核发育”。花药中（或花粉）小孢子的雄核发育，产生植物单倍体（haploid），进而可以通过染色体加倍产生加倍单倍体（doublehaploid，DH）。两者的异同点相同点：培养目的相同，均获得小孢子植株。不同点：（1）花药培养离体操作技术简单，而且，药壁组织有时可作为条件因子促进小孢子的发育。花粉培养没有药壁组织干扰；可计数小孢子产胚率；可观察雄核发育的全过程；单倍体产量高。但技术更复杂。（2）花药培养属于组织培养；而花粉培养属于细胞培养。9.2.1花药培养3）消毒70％酒精擦洗花蕾表面，或70％酒精浸泡30-60s后在1％次氯酸钠溶液中浸泡10-20min或在0.1％的氯化汞溶液中消毒3-10min，无菌水冲洗3-5次。图9-3小麦花药愈伤组织（左）及芽、根的分化（右）（引自陈耀锋，2002）与花药组织培养相比，花粉培养具有以下优点：花药培养产生的植株并不都是起源于花粉，容易受药壁、花丝、药隔等体细胞组织的影响，再生的植株中会出现不同倍性的个体，所以花药培养在诱导单倍体方面有一定的局限性，而分离的花粉粒培养可以克服这一不足。由于去除了药壁和其它连接组织的干扰，因此能更好地调节控制雄核发育的各种因子，而且能直接从单细胞开始观察整个雄核发育的过程。花粉是真正的单细胞单倍体，花粉群体的所有小孢子在培养条件下均能匀质地接受各种化学的、物理的因子处理，是突变体筛选及外源基因导入研究的有用材料，对育种有很大的意义。花粉群体大，一个花药中就有成千上万个小孢子，从花粉培养能得到更多的花粉植株。1）自然散落法(漂浮培养散落小孢子收集法)将花药接种在固体或液体培养基上，待花粉自动散落后，收集培养。2）机械游离挤压法在烧杯或研钵中用玻棒等挤压花药，将花粉挤出后收集培养。磁搅拌法用磁力搅拌器搅拌培养液中的花药，使花粉游离出来；超速旋切法通过搅拌器中的高速旋转刀具破碎花蕾、穗子、花药，使小孢子游离出来（此法应用最广）。4）甘露醇处理法（0.3mol/L甘露醇中25℃暗培养3～4d）5）小孢子纯化对上述方法获得的小孢子混合物进行分级过筛、梯度离心处理纯化小孢子。梯度离心前（小孢子形态、活力不一致）9.3.2.2花粉培养方式微室培养利用小的盖玻片和凹穴载玻片形成微室进行花粉培养条件培养基培养利用培养过花药的液体培养基或含失活花药提取物的培养基上培养。花药条件培养基、子房条件培养等。看护培养利用花药或花药愈伤组织释放出的活性物质促进花粉小孢子发育。看护培养图解9.4花药培养一步成苗与多级成苗相比，一步成苗有以下几个优点：1）一步成苗简化了培养程序，降低了培养成本，加快了成苗速度。2）一步成苗提高了花药培养效率。（提高绿苗率，主要通过胚状体成苗）3）一步成苗中绿苗的质量明显提高。（生长快而健壮）4）一步成苗简化了培养过程，减少了愈伤组织形成过程中的细胞变异，有效降低了白化苗产生频率。白化苗的重要特性:白化苗叶肉细胞的细胞质中，无正常发育的成熟叶绿体，只存在前质体到近乎正常叶绿体的各种形态的质体。花粉白化苗和绿苗在蛋白质、RNA和DNA的组成上有明显差异。花粉植株的白化现象是不可逆的，通过改变营养成分或其它条件都无法使白苗转绿。9.5.1白化苗产生的影响因素及机理1）内因供体植株基因型（如籼稻比粳稻白苗率高）、花粉发育时期。2）外因预处理、培养基成分、激素水平与种类、培养条件和方法、愈伤组织转分化时间等。3）机理核基因起关键作用，导致质体DNA缺失，产生白苗。另外无性系变异也可能是原因之一。9.5.2白化苗的控制烟草花药培养2)愈伤组织发育途径小孢子分裂数次形成愈伤，再分化形成花粉植株。此途径产生的植株会出现变异且倍性复杂。9.7.1倍性鉴定细胞形态学鉴定法叶片保卫细胞大小、单位面积上的气孔数及保卫细胞中叶绿体的大小和数目与倍性具有高度的相关性。植株形态学鉴定法单倍体植株瘦弱，叶片窄小，花小柱头长，花粉粒小，不结实。9.7.2单倍体植株的染色体加倍注射法禾谷类作物花培单倍体苗采用分蘖节注射法可以得到良好的加倍效果。小麦单倍体苗在分蘖前用0.05%的秋水仙素+1.5%的二甲基亚砜注射分蘖节，注射在清晨8～10时进行，共三次，每隔一天注射一次，每次用量25μL，这一加倍方法的加倍成功率可达到40%以上，最高可达68％。生长锥处理法双子叶植物多用此种加倍方法，可用涂布、滴下、带药棉球处理法进行加倍。9.7.2染色体加倍（为什么要进行加倍？）有秋水仙素、Oryzalin、trif