药桑椹花青素对DPPH自由基清除作用的测定DPPH自由基是一种稳定的有机自由基，其乙醇溶液呈紫色，在波长517nm处有强烈吸收。在有自由基清除剂存在时，DPPH的孤对电子被配对，从而使其褪色，褪色程度与其接受电子呈定量关系，因而可用比色法进行定量分析[10-13]。将AMAL、AMALV、AMNL及VC用蒸馏水配制成溶液，芦丁用甲醇配制成溶液，质量浓度如下：1、5、10、20、30、40、50mg/L。DPPH用无水乙醇配制成2×10-4mol/L的溶液。准确吸取样品待测溶液、DPPH溶液各2mL，混匀后室温下放置30min，于波长517nm处测定吸光度，每个样品平行测定3次，取其均值。按式(1)计算各待测样品对DPPH自由基的清除率。Ai－Aj清除率/%=(1－————)×100Ac式中：Ai为2mL样品溶液+2mLDPPH试剂混合液的吸光度；Aj为2mL样品溶液+2mL空白溶剂(无水乙醇)混合液的吸光度；Ac为2mLDPPH溶液+2mL空白溶剂混合液的吸光度。DPPH·标准曲线的制作准确称取[DPPH·]2.5mg,用甲醇定容到100mL,配制成质量浓度为2·5×10-2mg/mL的标准溶液,置冰箱中备用(现用现配)。分别取0、2、4、6、8、10mL标准溶液,用甲醇定容至10mL,最终质量浓度分别为0,5,10,15,20,25μg/mL。测定上述标准溶液在515nm波长处的吸光度,制作标准曲线(见图3-2)。测定方法和清除率的计算：对DPPH·自由基清除方法的测定参阅Brand-William(1995)[19]。分别取供试品溶液各20μL，40μL，60μL，80μL，100μL，量取浓度为1.01×10-1mol/L的DPPH·溶液相应的体积至4mL。立即混匀，用比色皿在515nm波长处进行测定,在一定时间间隔内测定吸光度，直到读数稳定。通过公式：清除率=[1-A1/A0]×100%来计算自由基抑制率.式中A0为溶剂的DPPH·在515nm处的吸光度,A1为抗氧化性物质与DPPH·反应后的515nm处的吸光度.清除50%自由基时样品浓度(IC50)的计算[20]将加入体积与其自由基清除率进行线性回归,得线性回归方程,再由该方程计算清除50%自由基时所需的样品浓度,即IC50值。IC50=供试浓度*加入体积/反应体系总体积3.1.2宁夏鹅绒藤水提物各组分对DPPH自由基的清除作用：3.1.2.1宁夏鹅绒藤水提物浸膏对DPPH自由基的清除作用：供试品溶液的制备：取一定的水提取浸膏，用水溶解，配制成浓度为10mg/mL的溶液，备用；测定方法：分别取以上制备的水提浸膏部分溶液各20μL，40μL，60μL，80μL，100μL，量取浓度为1.01×10-1mol/L的DPPH·溶液相应的体积至4mL。立即混匀，用比色皿在515nm波长处进行测定,在一定时间间隔内测定吸光度，直到读数稳定。通过公式：清除率=[1-A1/A0]×100%来计算自由基抑制率.式中A0为加入水为对照的DPPH·在515nm处的吸光度,A1为抗氧化性物质与DPPH·反应后的515nm处的吸光度.3.1.2.2石油醚部分对DPPH自由基的清除作用：供试品溶液的制备：取一定的石油醚部分浸膏，用石油醚溶解，配制成浓度为10mg/mL的溶液，备用；测定方法：分别取以上制备的鹅绒藤石油醚部分溶液各20μL，40μL，60μL，80μL，100μL，量取浓度为1.01×10-1mol/L的DPPH·溶液相应的体积至4mL。立即混匀，用比色皿在515nm波长处进行测定,在一定时间间隔内测定吸光度，直到读数稳定。通过公式：清除率=[1-A1/A0]×100%来计算自由基抑制率.式中A0为加入石油醚为对照的DPPH·在515nm处的吸光度,A1为抗氧化性物质与DPPH·反应后的515nm处的吸光度.