第三章细胞培养的基本方法第一节无菌操作技术第二节培养细胞的观察第三节细胞培养中常用的染色方法第四节细胞培养的污染和检测教学目的和要求由于体外培养的细胞没有抗感染能力，因此防污染是决定培养成功的首要条件。即便使用设备完善的实验室，若实验者粗心大意，技术操作不规范,也会导致污染。一切操作需要保证无菌和有条不紊。组织培养中最重要的，也是最基本的要求就是各项操作均应从无毒害、无污染的培养环境来考虑。培养基、器皿材料、接种工具、操作环境、培养室和超净工作台等各个环节都应注意。一、实验器具等的洗涤和材料的准备在开始实验前要制定好实验计划和操作程序。有关数据的计算要事先做好。根据实验要求，准备各种所需器材和物品、清点无误后将其放置操作场所(培养室、超净台)内，然后开始消毒。这可以避免开始实验后，因物品不全往返拿取而增加污染机会。培养玻璃器具的洗涤是非常重要的。用完后应洗净，再用蒸馏水冲一遍，烘干；用合适的方法灭菌。二、培养室和超净台的消毒（一）、无菌与有菌范畴灭菌工作是极其重要的。对于初学者来说，首先应建立有菌和无菌的概念。有菌的范畴：凡是暴露在空气中的物体，至少其表面都是有菌的。如植物表面、超净工作台的台面，未处理的工具、手等。无菌的范畴：物理或化学处理的物体（工具、器皿、培养基等）健康的动植物不与外部表面接触的组织内部可能是无菌的（有时也有内生菌，但不会影响培养，也不会污染）经过灭菌的物品有可能再次染菌（二）无菌操作室工作前后室内清扫、拖地，以防菌在空气中流动，特别真菌孢子。使用前，室内及超净工作台紫外灯杀菌30分钟，超净工作台酒精（75%）杀菌，工作中一直吹风。三、洗手和着装无菌培养室每天都要用0.2%的新洁尔灭拖洗地面—次(拖布要专用)，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要用75％酒精擦洗。然后紫外线消毒30min。在工作台面消毒时切勿将培养细胞和培养用液同时照射紫外线，消毒时工作台面上用品不要过多或重叠放置，否则会遮挡射线降低消毒效果。—些操作用具如移液器、废液缸、污物盒、试管架等用75%酒精擦洗后置于台内同时紫外线消毒。四、无菌培养操作1、首先点燃酒精灯，所有操作均在火焰近处并经过烧灼进行；冷却后才能使用；2、操作时，打开试管盖，要进行烧灼灭菌，但是时间要短。在火焰上烧瓶口。保证容器倾斜。3、进行操作时动作要准确敏捷，但是不宜太快，防止空气流动，增加污染的机会；4、超净工作台上的器具和用品要摆放合理；5、操作时器具不能触及瓶口以防止污染；6、不要说话、咳嗽、打喷嚏等，头发、首饰等注意；7、吸管、注射器等专管专用。污染材料应及时清除，高压灭菌。菌有两种，细菌成粘液状，真菌有菌丝。特别真菌危害极大。五、使用超净台注意事项2、长期未使用或新安装的超净台使用前必须对工作台和周围环境进行清扫，再采用化学灭菌或紫外线灭菌法进行灭菌处理；3、使用前用75％酒精擦洗台面，并提前用紫外线灭菌30min。关闭紫外灯后应启动鼓风机运转几分钟后再进行培养操作；4、净化工作区不应存放不必要的物品，以保持洁净气流型不受干扰；5、用后工作台要用75％酒精擦洗，以备后面工作人员使用；6、经常注意工作区上方微压表的指示，及时更换滤器。六、培养细胞的取材第二节培养细胞的观察组织块培养法消化培养法密度抑制（Densityinhibition）或接触抑制（Ccontactinhibition）培养细胞的生长过程2）传代期培养：初代培养的细胞生长到一定程度，即可连接传代，使其连续生长。一般正常二倍体细胞，不加附加条件，可传代30-50代，此时可发生染色体丢失、突变、细胞增殖变慢、停止分裂，进入衰退期，我们称之有限细胞系。这一转折点有人称之危象临界点（crisis）有些细胞的少数后代，或通过人工条件转化的细胞可通过这一期，获得持久的增殖传代能力，我们称细胞系，或无限细胞系，即一般通称的细胞系。（3）衰退期：传代细胞到达一定代数，即发生增殖缓慢，逐渐停止，进而发生衰退、死亡，多数传代细胞（或叫有限细胞系），不能通过所谓的“crisis（危象临界点），导致最终死亡，这一现象可能说明生物学衰老的细胞学基础。人胚胎成纤维细胞可以进行60代增殖，而80岁老人的肺成纤维细胞仅传代了16代后便死亡。表皮细胞寿命4-10天；红细胞3周-3个月，白细胞5-7天，神经细胞数年或更多。实体显微镜（解剖镜）倒置显微镜生物显微镜照相设备3、细胞计数法（cellcounting）用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度的一种方法。4、细胞生长曲线（cellgrowthcurve）是观察细胞在一代生存期内的增生过程的重要指标。横坐标为培养时间纵坐标为细胞密度注意：只有具备