细胞培养的基本条件培养细胞生长的条件一、实验室设计及设备器材◆必须树立无菌观念，坚持一贯的无菌操作，进行无菌处理。◆实验室应分为无菌室、准备室和洗刷消毒室，除洗刷消毒室须分隔开外，无菌室和准备室可在同一房间内，但需划分出不同功能区，即无菌操作区和培养、观察区。1）无菌室使用无菌室时应按以下顺序：☆每日（使用前）紫外照射（1－2小时），☆每周甲醛、乳酸、过氧乙酸熏蒸（2小时）☆每月新洁尔灭擦拭地面和墙壁一次的方式进行消毒。☆实际工作中，要根据无菌室建筑材料的差异来选择合适的消毒方法。☆注意防止无菌室的污染。造成无菌室污染的可能包括：送入无菌室的风没有被过滤除菌；进出无菌室时，能使外界空气直接对流进无菌室的操作间；等。2）超净工作台（净化工作台）超净台的使用与保养：无菌工作台操作布局示意图3）无菌箱（1）大型设备工具类①无菌室、实验室、超净工作台、无菌操作箱等②二氧化碳（CO2）孵箱、恒温孵箱、试管架倒置显微镜④高速离心机（水平式500～4000r/min）⑤普通、低温冰箱及液氮装置⑥药品柜、器械柜、实验台等（3）配液用具培养板培养瓶酶标仪微孔板震荡器二、实验器材的处理★注意让水灌满瓶皿，以利充分浸泡、冲洗。★有污染的器皿必须先消毒灭菌后再浸泡、冲洗。（3）浸酸清洁液配制注意事项清洗示意图2）塑料器皿冲洗3）胶塞等橡胶类用品的处理4）金属器械的清洗5）除菌滤器的处理3、消毒灭菌三、培养用液1.细胞培养对水的要求2.平衡盐溶液BSS的配制要求：水：新鲜配置的三蒸水或去离子水1.pH7.2PBS贮备液（10×）配法NaCl8.5gKCl0.2gNa2HPO4﹒12H2O2.85gKH2PO40.27g溶于100ml双蒸水中2.PBS使用液配法贮备液50ml双蒸水450ml成分3.细胞培养常用试剂◆胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，影响细胞骨架，从而使细胞分离。◆胰蛋白酶液浓度越高，作用越强，但超过一定限度会损伤细胞。◆胰蛋白酶是一种黄白色粉末，用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是0.25％。用滤器过滤除菌。◆蛋白酶液消化时间：2-10分钟。◆最适作用条件为pH8.0、37℃◆用含血清培养液终止其对细胞的消化作用（2）EDTA(0.01-0.02%)（3）胰酶-EDTA（4）胶原酶(1-5mg/ml)2）pH调整液◆细胞培养液PH浓度的调节最常用的为加NaHCO3的方法，因为NaHCO3可供CO2，但二氧化碳易于逸出，故最适用于封闭培养，◆羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）因其对细胞无毒性，也起缓冲作用，有防止PH迅速变动的特性而用于开放细胞培养技术中，其最大优点是在开放式培养或细胞观察时能维持较恒定的PH值。◆二氧化碳既是细胞代谢产物，也是细胞生长繁殖所需成分，它在细胞培养中的主要作用在于维持培养基的PH值。◆大多数细胞的适宜PH为7.2-7.4，偏离这一范围对细胞培养将产生有害的影响。但细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。有资料显示，原代羊水细胞培养PH6.8时最适。3）抗菌素溶液：抗生素液抗生素4）L-Glutamin溶液4.常用培养基天然培养基（naturalmedia)：（1）鸡血浆的制备①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）②多种金属离子③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等。⑤各种生长因子⑥转移蛋白⑦不明成分一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加10％血清．对于血清支持细胞生长的生物学效应已得到证明，但对血清中的复杂成分至今尚未完全清楚．血清中不仅存在促细胞生长因子，同对也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。血清质量好坏是实验成败的关键。常用血清有胎牛血洁、新生牛血清、小牛血情、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。血清的灭活（消除补体活性）：56℃，30分钟血清的消毒：过滤除菌3.水解乳蛋白（Lactalbuminhydrolysate,LH）合成培养基是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前已设计出许多种培养基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培养基主要成分是氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。优点：标准化生产，组分和含量相对固定。成本低缺点：缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要。人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基（如血清）。常用的