GLP-1发酵制备的工艺流程一、前言胰高血糖素样肽-1（glucagonlikepeptide-1,GLP-1）是作为肠道L细胞分泌的肠促胰素的概念存在，具有葡萄糖依赖的胰岛素促泌作用、抑制胰高血糖素分泌、刺激β细胞增殖分化和抑制β细胞凋亡、抑制食欲及摄食、延缓胃排空，能恢复2型糖尿病患者受损“肠促胰素效应”，是一类具有潜在价值的治疗糖尿病的药物。二、设计依据以一株GLP-1融合蛋白的重组大肠杆菌HT02为研究对象。在20L发酵罐中，考察记录葡萄糖浓度、诱导期温度、溶氧水平以及单位体积融合蛋白产量。在基础上，进一步考察以甘油管代葡萄糖作为碳源、甘油补加策略及氮源补加策略等因素对重组大肠杆菌HT02生长以及GLP-1融合蛋白表达的影响，建立分批补料培养工艺，使菌体密度、单位菌体产融合蛋白量、GLP-1融合蛋白表达水平以及单位发酵体积融合蛋白量。最后在1200L的发酵罐上进行了初步工艺过程放大，通过采用提前诱导、增加接种量的方式，克服二级种子液培养工艺导致的GLP-1融合蛋白表达水平下降问题，最终得到菌体密度、单位菌体产量、GLP-1融合蛋白表达水平以及单位发酵体积融合蛋白量。三、设计方案1材料与设备物料名称级别生产商葡萄糖AR西陇科学甘油AR西陇科学酵母浸粉生物试剂安琪酵母酵母蛋白胨生物试剂安琪酵母消泡剂生物试剂OUVRIE(NH4)SO4AR广试重组大肠杆菌工程菌生物安全柜四川新德医疗器材有限公司空气压缩机上海熊猫集团股份有限公司20L发酵罐镇江东方生物工程设备技术有限公司卧式矩形压力蒸汽灭菌柜四川新德医疗器材有限公司振荡培养箱上海知楚仪器有限公司紫外可见分光光度计上海美谱达仪器有限公司2电极极化与校正（1）pH电极取出pH电极用纯化水清洗，随后安装金属保护套，与发酵系统插头相连接，置于饱和氯化钾中，将pH校正液从4度冰箱中取出，待恢复至室温方可使用，采用两点校正法，PH4.01与PH7.0两点标定其pH值，标定完毕放至PH7.0的校正液之中复测的PH值与之前参考PH值与之比对，参考值±100内pH校正无问题，若大于100需重新校正，校正后，将pH电极放在饱和氯化钾溶液中。发酵罐使用前一天需要对发酵罐的电极进行校正，确保实验批次的pH不会有偏差，pH校正液需要定期更换，否则会影响测量的准确性。（2）溶氧电极使用前需要检查溶氧电极中的电解液是否足够，若电解液不够会影响实验溶氧反馈情况。补加后，安装金属保护套，将发酵系统的插头与之相连接，溶氧电极的极化需连接后放置空气中极化8h以上，上罐前一天安装好溶氧电极极化后置于饱和亚硫酸钠中等待上罐，0点校正是在实消蒸汽灭菌30min时，等参考值稳定校正其0点；满点校正，灭菌后待实验批次各参数稳定，标定其参考值为满点。320L种子罐灭菌前准备（1）启动发酵操作系统、冷水机、蒸汽发生器、空气压缩机、空气干燥机。（2）发酵罐使用时，蒸汽发生器解压阀解压后的压力控制在0.3-0.4MPA，空气压缩机解压阀后的压力控制在0.4-0.5MPA.（3）使用前检查发酵罐降温为自来水降温，关闭冷循环水。（4）检查各部件螺丝是否拧紧，空气过滤器是否为保压状态，空气过滤器不使用时需要保证其里面为正压。（5）使用蒸气时需提前打开蒸汽发生器，待其达到压力之后，打开蒸汽阀门通过排水阀排掉管路的冷凝水，蒸汽过滤器排污，蒸汽管道到20L发酵罐分两路蒸汽，一路为工业蒸汽，用于夹套升温与发酵罐的实消，另一路为净化蒸汽，用于空气过滤器灭菌。4空气过滤器灭菌及吹干（1）总空气阀门通过转子流量计调节流速，转子流量计过来有一个控制空气进入空气过滤器的阀门，一个蒸汽进空气过滤器阀门，空气过滤器下方有排污阀，总空气阀门为常开状态，关紧空气进入空气过滤器阀门，打开蒸汽进过滤器阀门，打开空气过滤器下方排污阀，排尽过滤器中的冷凝水，保证排污阀有蒸汽吹出，打开蒸汽进过滤器阀门。（2）压力到0.12MPA，开始计时，点击上位机的“空气灭菌”光标，灭菌35min。灭菌时间到，吹干过程为40min，吹干完毕开始自动空气过滤器保压。5配料（1）称取酵母浸粉、酵母蛋白胨、葡萄糖，比例按照1：2：2来称量；用纯化水定容至7L，灭菌后体积为9L。（2）用胶头滴管加入2mL消泡剂。（3）打开发酵操作系统变频，打开电机，手动升转，转速为100rpm。6发酵罐灭菌（1）首先进行夹套灭菌，戴上工地手套打开夹套进蒸汽阀门，待夹套压力表有波动，减压调整至0.14，缓慢打开蒸汽排污阀，排尽管中蒸汽冷凝水。待排污管道排出蒸汽，维持1分钟后，关闭蒸汽排污阀。（2）待温度升至80℃关闭电机停止