流式细胞仪的概述流式细胞仪的机型流式细胞仪主要技术指标流式细胞仪构造流动室及液流驱动系统改变样本的进样速率开关,可提高采样分析的速度,但是,并不提高样本流的速度,而是改变了细胞间的距离,样本流变宽,细胞间距离缩短,这样单位时间内流经激光照射区的细胞数就增加。激光焦点处能量分布为正态分布,中心处能量最高,因此当样本速率选择高速(Hi)时,处在样本流不同位置的细胞或颗粒,受激光光照射的能量不一样,从而被激发出的荧光强度也不相同，这就会造成测量误差,当在检测分辨率要求高的实验时如，DNAanalysis应选用低速(Low)每个细胞所携带荧光物质被激发出的荧光信号强弱，与被照射的时间和激发光的强度有关，因此细胞必须达到足够的光照强度。为保证样品中细胞是一个一个分别受到光照并且受照强度十分一致,须将样本流与激光束正交且相交于激光能量分布峰值处激光光源和光学系统光学系统由若干组透镜、小孔、滤光片组成，大致可分为流动室前和流动室后两组。流动室前的光学系统由透镜和小孔组成，透镜和小孔（一般为2片透镜、1个小孔）的主要作用是将激光光源发出的横截面为圆形的激光光束聚焦成横截面较小的椭圆形激光光束，使激光能量成正态分布，使通过激光检测区的细胞受照强度一致，最大限度的减少杂散光的干扰流动室后光学系统(1)长通滤片(LP)：使特定波长以上的光通过，特定波长以下的不通过。如,LP500允许500nm以上的光通过，而500nm以下的光吸收或返回。(2)短通滤片(SP)：使特定波长以下的光通过，特定波长以上的光吸收或返回。(3)带通滤片(BP)：允许相当窄的一波长范围内光通过，一般滤片上有两个数，一个为允许通过波长的中心值，另一为允许通过光波段的范围。如BP500/50表示其允许通过波长范围为475nm-525nm。绿色荧光(FITC)：LP550和BP525橙红色荧光(PE)：LP600和BP575红色荧光(CY5)：LP650和BP675流式细胞仪的使用开机、联机cytometer-computer；检查鞘液箱是否有足够鞘液（3L）。盖子关紧。鞘液箱处于压力下。（黑色金属板）管道没有渗漏。检查废液箱预装400ml含氯消毒液没有渗漏在cellquest下：设置参数：PMT-voltage;compensation;shreshold;status(standby-3-4V;ready-14-15V)counter建立自己的文件上机（管道密闭）：气阀关闭；”run”PMT-voltage关机上含有3ml的含氯消毒液（10％），底下的托架推至一边持续1min。回归托架，在run的状态下，高速继续上样5min。改用蒸馏水，重复上述过程。探针继续放在蒸馏水中。换至”standby“.脱机关电源常见问题Fluorescencecompensation:单标记荧光调节补偿需要调节补偿的参数对FL1/FL2；FL2/FL3；FL3/FL4对照设置-以检测带有FITC/PE/APC的样品为例1.空白、阴性对照2.单标记对照：FL1(FITC);FL2(PE);FL4(APC)3.混合对照：以上对照的两两组合；3个混合FL1UncompensatedvsCompensated1.流式细胞仪参数物理参数前向角参数(FSC)反映细胞的相对大小,与细胞直径的平方密切相关。一般选取FSC作阈值，来排除样品中的各种碎片及鞘液中的小颗粒，以避免对被测细胞的干扰。侧向角参数(SSC)反映细胞的相对粒度或内部复杂度，对细胞膜、胞质、核膜的折射率更为敏感，可提供有关细胞内精细结构和颗粒性质的信息。ForwardAngleLightScatter(FSC)FALSSensor根据FSC/SSC可以将全血中的淋巴细胞，单核细胞和粒细胞分开荧光参数自发荧光：未经荧光染色，细胞内部的荧光分子经激光照射后发出的荧光信号。自发荧光的细胞成分：核黄素，细胞色素等。死亡细胞的自发荧光较高需要设置阴性对照。特征荧光：经标有特异荧光素的单克隆抗体染色后经激光激发发出的荧光。FITC,Alexa488,GFP,CFSE,Fluo-3,R123Laser激发光波长(Ex)发射光波长(Em)Fluorescein(FITC)ExcitationPropidiumIodideAllophycocyanin(APC)如何选择荧光偶联的抗体直接标记间接标记Avidin-Biotinmethod荧光抗体的搭配流式细胞仪的数据显示和分析2.双参数数据显示和分析表示：一维直方图、二维点阵图、等高线图和密度图显示和分析。二维图：横坐标-FSC/SSC/FL1/2/3/4；纵坐标-FSC/SSC/FL1/2/3/4根据阴性对照