流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM）定义流式细胞术是一种可以快速、准确、客观，并且能够同时检测快速直线流动状态中的单个细胞的多项物理及生物学特性，加以分析定量的技术，同时可以对特定群体加以分选。研究对象为各种细胞（如外周血，骨髓，细针穿刺，灌洗液，实体组织，悬浮或贴壁培养的细胞），微生物，人工合成微球等。最终获得单细胞悬液（天然，机械研磨/消化）。特点：检测速度快，分析样本量大；可同时分析单个细胞的多种特征；强大的分选功能。所用流式细胞仪（FlowCytometer）是集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的一种新型高科技仪器。有分析型流式细胞仪和分选型流式细胞仪。流式细胞仪的检测范围1.上机检测单色/双色/多色样本参数调节电压、阈值、设门、补偿举例：FACSCalibur可检测FL1-4四个通道的4个颜色流式抗体荧光标记搭配将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型以及活细胞的分类。由流式细胞仪能检测多少个通道（由有多少激光以及每激光的功能决定的）、需要同时检测多少个指标、厂家的抗体有多少种荧光标记等决定。不推荐APC和PE-Cy5一起使用，上流式以后，容易导致补偿过度。推荐使用AlexFluro488和AlexFluro647。因为这些荧光非常明亮，对激光非常稳定，适合流式细胞仪的光谱性质，对PH值不敏感，具有水溶性。此外，他们联合使用时发射光谱存在巨大差异，无需补偿。数据显示1.直方图（Histogram）2.二维点图（DotPlot）3.等高线图（ContourPlot）4.密度图（Density）5.三维图（3DPlot）等单参数直方图分析双参数散点图分析散点图FCM的主要测定指标：FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)FCM标记方法单标：一种单抗/tube--FL1,FSC,SSC（三参数）双标：两种单抗/tube--FL1,FL2,FSC,SSC（四参数）三/四标：三种单抗/tube、四种单抗/tube--FL1-FL3/4,FSC,SSC分析时，使用FL2-w和FL2-A显示。FL2-A是指荧光峰面积，反映了细胞DNA含量（前提是用Rnase处理去除RNA）；,FL2-H是指荧光峰的脉冲高度；FL2-W是指检测荧光峰的脉冲宽度，该值通常在做细胞周期分析时应用,用于去除粘连细胞。流式测细胞周期，一般分为G0/G1,S,G2/M期三部份，如果有凋亡，在G0/G1期前面有个凋亡峰(也称sub-G0期)，而如果分析时细胞窗口没设置好，可能在最前面还有细胞碎片峰。外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）对血液中淋巴细胞设门（R1）分析其免疫表型细胞表面标志物检测从增殖的角度分类高等动物细胞依据细胞DNA含量（横坐标）：G1期：DNA复制还没开始，也是DNA含量最少的，即流式检测结果图的第一个峰；S期：DNA开始复制，到完成复制，是一个一倍DNA到二倍DNA的过程，在流式结果图中显示期跨度特别大（第二个不高但很宽的峰）；G2期：DNA复制完成至分裂的一段时间，此时细胞内含二倍DNA，在流式结果图中的第三个峰；M期：细胞分裂过程，此时细胞内也是二倍DNA，用DNA含量的方法是无法与G2期分开，所以有第三峰明显升高时报告：G2/M期阻滞。流式细胞仪检测细胞凋亡2.光散射特性凋亡细胞形态的改变影响其光散射特性。前散射光（FSC）与细胞的大小有关，而侧散射光(SSC)反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。双染和单染在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的PS由脂膜内侧翻向外侧。AnnexinV是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的PS与凋亡早期细胞的胞膜结合。故AnnexinV被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将AnnexinV进行荧光素（EGFP、FITC）标记，作为荧光探针，利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。与FITC的绿色荧光信号相比，EGFP的绿色荧光信号具有信号强，不易淬灭，稳定性高等优点。碘化丙啶（PropidiumIodide,PI）是一种核酸染料，溴化乙锭的类似物，不能透过完整的细胞膜，但能够透过凋亡中晚期细胞和死细胞的细胞膜，嵌入双链DNA后释放红色荧光。故将AnnexinV与PI匹配使用，可将处于不同凋亡时期的细胞区分开。注：1.AnnexinV-EGFP，PI避光保存及使用。PI有毒，操作时要戴手套。2.上机前要过滤细胞！因为PI具有很强的粘附性，容易使细胞聚团。流式细胞仪