实验九：食品中维生素C的含量测定一、目的要求理解2,4–二硝基苯肼比色法测定抗坏血酸总量的基本原理。学习其操作方法和了解影响测定准确性的因素。二、实验原理总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸，样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2,4–二硝基苯肼作用生成红色脎，其呈色强度与总抗坏血酸含量呈正比，可进行比色定量。三、仪器与试剂（二）仪器1、恒温箱或电热恒温水浴锅。2、可见光分光光度计。3、捣碎机。四、实验步骤3、呈色反应（1）取3支试管，各加入4mL经氧化处理的样品稀释液。基中一支试管作为空白，向其余两试管加入1.0mL2%2,4–二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37℃±0.5℃恒温箱或恒温水浴中，保温3h。（2）3h后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中。空白管取出后使其冷到室温，然后加入2%2,4–二硝基苯肼溶液1.0mL，在室温中放置10min~15min，后放入冰水内。其余步骤同试样。4、85%硫酸处理当试管放入冰水冷却后，向每一试管（连同空白管）中加入85%硫酸5mL，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。将试管自冰水中取出，在室温放置30min后比色。5、样品比色测定用1cm比色皿，以空白液调零点，于500nm波长测定吸光值。6、标准曲线绘制（1）加2g活性炭于50mL标准溶液中，振动1min后过滤。吸取10.00mL滤液放入500mL容量瓶中加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度。抗坏血酸浓度20μg/mL。吸取5，10，20，25，40，50，60mL稀释液，分别放放7个100mL容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的深度分别为1，2，4，5，8，10，12μg/mL，为抗坏血酸标准使用液。（2）分别吸取4mL各不同深度的抗坏血酸标准使用液，于7个试管中，吸取4mL水于试剂空白管，各加入1.0mL2%2,4–二硝基苯肼溶液，混匀，将全部试管放入37℃±5℃恒温箱或恒温水浴中，保温3h。3h后将8个试管取出，全部放入冰水冷却后，向每一试管中加入5mL85%硫酸，滴加时间至少需要1min，边加边摇，。将试管自冰水取出，在室温放置30min后，以试剂空白管调零，并比色测定。以吸光值为纵坐标，抗坏血酸含量（mg）为横坐标绘制标准曲线或计算回归方程。五、结果计算六、考思考题六、考思考题