第一节核酸分析技术一、核酸电泳琼脂糖凝胶电泳的基本过程不同浓度琼脂糖的凝胶分离范围影响DNA在凝胶中迁移速率的因素：琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡过程中DNALadder的形成特殊的凝胶电泳基本过程同DNA电泳一样，但应明确一点的是，因为RNA分子对RNA酶的作用非常敏感，因此必须用对RNA酶有抑制作用DEPC水来配置所有溶液，所有与RNA接触的仪器和装置都要严格处理以尽量减少RNA酶对样品的降解；另外，因为RNA分子有二、三级结构可以影响其电泳结果，因此电泳时应在变性剂存在下进行，常用的变性剂为甲醛和戊二醛。二核酸杂交技术SouthernBlot操作步骤：原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同SouthernBlot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。操作过程（三）探针标记技术三PCR技术（一）原理：双链DNA通过高温变性解离成互补单链DNA－－－变性↓与一对寡核苷酸引物（5’，3’）降低温度退火DNA加热变性+引物慢慢冷却使其结合，形象地称为退火↓适温延伸5’/3’引物形成新链变成4条链DNA－－延伸↓第二轮：变性—退火—延伸呈指数增长理论值：一轮一倍10轮103=1000倍20轮10630轮109理论模板扩增30轮1ng-----------1g实际模板扩增30轮1ng-----------10g1TaqDNA聚合酶：水生栖热菌(thermusaquaticus,Taq)的DNA聚合酶①5’3’DNA聚合酶活性；②无3’5’外切酶活性，35轮0.25%错配，与原始模板有差别；最适聚合酶温度72℃，选择72℃延伸半衰期：92.5℃130min95℃40min97.5℃5—6min变性温度：≤95℃使其在整个扩增循环中保持足够活性pfuDNA聚合酶2.引物人工合成短寡核苷酸20bp-25bp→Tm=55℃-60℃，Tm值要相近，每条10-50pmol/100l◆设计原则：（1）靠近5'上游Primer与双链DNA正链相同3'下游Primer与双链DNA正链互补，与负链相同正链5'—————3'——上游Primer——下游Primer负链3'—————5'例如：IL-3正链5'GCTCCATGACCCAG-----------GCGATCTTTTGAGTCCAA3'负链3'CGCTAGAAAACTCAGGTT5'上游~：与其相同下游~：先写出相应负链3'→5'然后倒过来5'→3'所以负链Primer：5'-TTggACTCAAAAgATCgC-3'（2）Primer本身不要出现内部互补序列形成loop环，内部二级结构如：GGGTCGATTCCTACCCATGC（3）注意减少Primer间互补序列导致2个Primer形成dimer一般不要超过3个互补bp如：CCCATGCATGGAGTC::::::::GGGTCTATCAGTAAGC修饰如：32P、生物素、荧光素，不影响其效果突变：AGCTCCATGACCCAG5'CGCTCCATGACCCAG3'注意：绝不可以在3'端进行上述改造∵DNA聚合酶是5'→3'聚合，若3'端改造→不能互补→不能延伸（5）primer5’端增加碱基①内切酶识别点：（G）GAATTCGCTCCATGACCCAG↑保护bp对PCR产物cloning有很大好处便于内切酶消化，不同内切酶需保护bP数量不同EcoRI1BglII2-3XbaI2-3HindⅢ>3BamHI2-3PstI>4XhoI>4NotI>10如果所用保护bp数量不合适→影响内切酶消化→影响下步克隆∵未切开，连接不上②ATG起始密码③TAA、TAG、TGA终止密码如：可溶性受体的表达，无膜内区、穿膜区，只有膜外区。3.模板：可选：DNAmRNA→逆转录→cDNADNA包括：质粒噬菌体染色体DNA较小较大①目的gene是单拷贝变性较易变性较难②非常大，变性难模板用量Plasmid:lngChromosome:300-500ng注意：防止交叉污染4.dNTP：四种脱氧核苷酸，基本原料终浓度：50M注意：不稳定，保存时间长会失效5.Mg2+TaqDNA聚合酶作用时需要Mg2+不同的酶需不同Mg2+Taq：较少，Mg2+对反应影响很大，0.5-1.5mM终浓度pfu：Mg2+2-3mM，dNTP、primer用量约增加一倍外界影响：EDTA鳌合Mg2+∴选较低浓度TE(10mMTris,1mMEDTA)；DNA模板、引物和dNTP的磷酸基团均可与M