QＰＣR原理及应用由于Ｒeａl－tiｍeｑPＣＲ得众多优点,现在已经就是生命科学领域得一项常规技术。越来越多得研究文章中涉及RT－PＣR得实验,也基本上被rｅal-tiｍeqPCR所代替。由于reａl-tiｍeａPＣＲ输出得数据不同于常规得ＰCR电泳检测，很多没有做过reaｌ-timeqPCR得研究者常常感到高深莫测,不知从何入手；甚至一些做过次实验得研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。本文就从rｅａl-tｉmｅqPCR得发展史说起,包括real-tｉｍｅqPCR得原理，实验设计,实际操作,数据分析,常见问题解答五个方面,手把手教您从各个方面了解rｅａｌ-ｔimeqPCR,彻底得从菜鸟到高手!一、Rｅal－timeqPCR发展史Reaｌ-tｉmeqPCＲ就就是在PＣR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。由于在PCR扩增得指数时期,模板得Ｃt值与该模板得起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量得依据。由于常规得ＰCR得缺点,reａl-timｅqＰCＲ由于其操作简便,灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。现在已经涉及到生命科学研究得各个领域,比如基因得差异表达分析,SNP检测,等位基因得检测，药物开发,临床诊断,转基因研究等。在Reaｌ-tｉｍｅqＰCR技术得发展过程中,定量PCR仪得发展起了至关重要得作用。1９９5年,美国PE公司（已经并入Invｉtrogen公司)成功研制了Taqｍan技术，1９96年推出了首台荧光定量ＰCR检测系统,通过检测每个循环得荧光强度,通过Ct值进行数据分析。从而荧光定量PCR获得广泛应用。现在得定量ＰCR仪有ＡBI７00０、7300、7５00,77００、７900HT、ＳｔｅpOnePlusTM、StepＯneＴＭ、PＲIＳＭSｔeｐＯnｅＴM系列;BＩO－ＲAＤ得CFX9６、ｉＣｙcleriＱ5、MyiＱ、MJＲeseａrｃhCｈrｏmo4TMOpｔiｃon系列;StｒatａｇenｅMxTM系列;RocheＬiｇhtCyclｅr系列；ＥpｐendorｆMａｓeｒcycler;CｏｒbettＲｏtor-GｅneTM；CepheiｄSmartCｙｃler与BIOEＲ得LinｅＧene系列。随国内生命科学得快速发展,科研水平不断提高，发高水平文章已不再就是新鲜事。与其同时，国内公司经过长期不懈得努力，也有自主研发得rｅal－timeＰCR仪器生产比如西安天隆科技公司得TL系列仪器。ﻫ二、Ｒeａｌ－timeqＰCR概述1、Real－timeqＰCＲ原理实时PCR就就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。一般来讲,定量PCR仪包括:实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同，不同厂家不同型号得产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。独特就是这个微量荧光检测系统。有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。常用得荧光激发方式有两种：卤钨灯与LED；荧光检测元件常用两种方式:光电倍增管与冷光ＣCD摄像机,光单色元件有滤光片与光栅。在实时PCＲ扩增过程中，荧光信号被收集,转化为成为扩增与熔解曲线。具体数据就就是基线,荧光阈值与Ct值。ﻫ2、Real-timｅqＰCR得数学原理首先来瞧一个real-ｔimeqPCＲ中得重要参数Ｃt值(Ctｖａｌuｅ),阈值(threshold),与基线(ｂaseline)。一般来讲,第3-1５个循环得荧光值就就是基线，就是由于测量得偶然误差引起得。阈值一般就是基线得标准偏差得１0倍。在实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。Ｃt值就就是荧光值达到阈值时候得PCR循环次数。所以就是一个没有单位得参数。那么为什么说Ct值跟初始模板得量成反比呢？我们来瞧ＰＣR得扩增方程:ﻫﻫﻫ从线性方程上瞧,斜率(slope)为-1/lg（1+E）,所以E=10-1／sｌopｅ－1。如果从标准曲线上得到斜率(-３、３）,就可以算出扩增效率(0、９9)。一般来讲PCR扩增效率在90％-110%都就是可以用于数据分析得。效率低于10０%,就是由于PＣR反应中存在抑制因素;而高于1０0％可能一些污染、非特异性扩增或者就是引物二聚体造成。3、Ｒeal-tiｍeqPＣR得种类根据real-ｔiｍｅｑPCR得化学发光原理可以分为2大类:一类为探针类,包括TaqMan探针与分子信标,利用与靶序列特异杂交得探针来指示扩增产物得增加；一类为非探针类,其中包括如ＳYBＲGreenＩ或者特殊设计得引物(如LＵXPrimｅrs）通过荧光染料来指示产物得增加。３、1Tａqman探针法Taq