.精选范本一、TotalRNA的提取：取出样本，放入灭过菌的研钵中，倒入液氮，研磨，整个过程要始终保持有液氮，15min左右，研磨充分后加入1.5ml的EP管，加入1mlTrizol，充分匀浆。（另一种，加入trizol会冻起来，就一直研磨，直到最后化成液体。）室温静置10min，12000g，4度，5min，上清转移到新的1.5ml的EP管中加入1/4体积的氯仿，振荡混匀，室温静置15min，12000g，4度，15min，上清转移至新管；加入等体积的异丙醇，轻轻摇匀，室温静置10min，12000g，4度，10min弃上清，留沉淀，加入1ml的75%乙醇清洗沉淀，7500g，4度，5min，弃上清保留沉淀。重复三次弃上清留沉淀，自然风干（5~10min），加入32ulDEPC处理过的水，测OD260/280的值，根据结果调整至1μg/μl=1000ng/μl，立即进行反转录，剩余的RNA标好号存放在-80℃下。附：1OD260=40μg/ml用样本跑电泳，确定RNA的完整性，注意在这之前把胶配好。（可无）可见明显的两条带，并且28S是18S亮度的两倍，还有下边一条不太明显的5SRNA的条带。证明RNA完整无降解。二、反转录：说明书：10μl反应体系可最大使用500ng的TotalRNA。20/1μg（以前用的40，下次用20）20ul的体系：先把buffer和RNaseFreedH20和enzyme配成mix5×PrimeScriptBuffer（forRealTime）：4μlPrimeScriptRTEnzymeMixI：1μlOligodTPrimer（50μM）：1μlRandom6mers（100μM）：1μl总RNA：1μl(1μg/μl)RNaseFreedH2O：12μl反转录反应条件如下:37℃15min（反转录反应）85℃5sec（反转录酶的失活反应）4℃-20℃分装保存（尽量不要反复冻融，avoidfreeze-thawcycles）三、内参检测β-actin50µl体系试剂使用量10*taqbuffer5µldNTP4µlPrimer-F（100µM）0.5µlPrimer-R（100µM）0.5µlTaqE0.25µl模板<500ng1µl灭菌蒸馏水加至50µlPCR反应条件:扩增1kb的DNA片段的PCR反应条件如下：预变性：95℃，3min98℃10sec.55℃30sec.（下次60℃，去掉非特异性）72℃30s（对于80bp的内参来说是不是可以省去）72℃5min.4℃保存电泳：2%琼脂糖凝胶，125V，15min，注意换成20bp的marker，不要加太多。四、定量PCR电泳检测，条件同上。增大至50个循环。五、分析数据引物AT1F:GCCCTTCGGCAATCACCTATAT1R:TGAGACACGTGAGCAGGAACAT2F:CCTGGCAAGCATCTTATGTAGTTCAT2R:CCGGAAATAAAATGTTGGCAATACTINFGCAGATGTGGATCAGCAAGCRGGCGGACTGTTACTGAGCT