LR反応標準プロトコールver2.1(2005.4.1)LR反応標準プロトコールpENTR-promoterとpDEST-MyGeneからpGpromoter-MyGeneを作る。pENTR-promoterをattL1とattL2の外側でだけ切断する制限酵素＝酵素ApDEST-MyGeneをattR1とattR2の内側でだけ切断する制限酵素＝酵素Bとする。＜＜通常起こるべきattL1－attR1サイトの組み換えがこれ以外の場所で起こった例が複数回観察されている。これを避けるために、酵素AはpDEST-MyGeneのattL1のできるだけ近く（すぐ左側）で切断するものを使用することを強く推奨する。＞＞○pENTR-promoterを酵素Aで切断、pDEST-MyGeneを酵素Bで切断（pENTR-promoterあるいはpDEST-MyGeneプラスミド作成時のPCR反応によるエラーの可能性がある場合、独立な２クローンを用いて別々に反応を行う。正しく機能することが確かめられているプラスミドの場合はその一種だけでいい。）（"buffer"は酵素A、Bにそれぞれ適したものを使う。）（プラスミドは0.5～1μgを切断。制限酵素は10unitが標準。下記はそれぞれ通常の濃度の場合なので、原液が薄いときは適宜量を調節する。場合によっては全量を増やすことも有り得る。）pENTR-promoter／酵素ApDEST-MyGene／酵素BH2O39μlH2O39μl10×buffer5μl10×buffer5μlpENTR-promoter5μlpDEST-MyGene5μl酵素A1μl酵素A1μl計50μl計50μl↓37℃エアインキュベーター１時間（以上）↓→5μlを電気泳動して切断を確認。コントロールとして、処理していないpENTR-promoter,pDEST-MyGeneを0.5μl隣に泳動する。↓75℃のウォーターバスで15分間インキュベート↓氷上で２～３分冷やす。55μlのTEを加える。↓○エタノール沈澱10μlの3MNaOAc(sodiumacetate;酢酸ナトリウム)(pH7.0)を加え、mixする。250μlのEtOH(ethanol；エタノール)(-20℃に冷えたもの)を加えてmixする。↓氷の上で15分静置。↓4℃で12000rpm×15分遠心沈澱（見えないことが多い）を乱さないように液を吸って除く。70%EtOH(-20℃に冷えたもの)を加える。mixしない。↓すぐ4℃で12000rpm×2分遠心沈澱（ここで見えなくなることもある）を乱さないように液を吸って除く。↓真空ポンプで減圧乾燥。10μlのTEを加えて溶解する。→保存は-20℃○LR反応NegativeSampleConrolTE4μl3μlLRreactionbuffer(5X)2μl2μl↓およそこの量になるように分量を加減する。pDEST-MyGene／酵素B2μl2μl～300ngENTR-promoter／酵素A-1μl100～300ng計8μl8μlLRClonaseEnzymeMixを-70℃から出して氷上で解かす（約２分かかる）。LRClonaseEnzymeMixを約２秒間×２回Vortex上記反応液にそれぞれLRClonaseEnzymeMixを2μl加え、約２秒間×２回Vortex↓25℃エアインキュベーターで１時間放置ProteinaseKSolutionをそれぞれ1μl加える。↓37℃10分ウォーターバスでインキュベート氷の上で解かした〜100μlのDH5αcompetentcell（自作）に全量加える。↓氷上30分放置↓42℃30秒ウォーターバスでインキュベート氷の上に1～2分置く。LBAmp(40μg/μlアンピシリン入り)プレートにぜんぶ広げる。↓37℃一晩保温コロニーを１個ずつ1.5mlLBAmp液体培地に植える↓37℃一晩保温プラスミド調整→制限酵素で構造確認