pENTR-promoter作成標準プロトコールver2.1(2005.3.30)pENTR-promoter作成標準プロトコール方法１：＜プロモーターを持つプラスミド（プラスミドXとする）のプロモーター部分を制限酵素で切り出し、制限酵素で切断したpENTR1Aとライゲーションにより結合し、attL1とattL2の間にプロモーターが挿入されたpENTR-promoterプラスミドを作成する。＞方法２：＜プロモーターを持つプラスミド（プラスミドXとする）または線虫のゲノムDNAからattB付加PCRでプロモーターを増幅後、BP反応でpDONR201と組換え、attL1とattL2の間にプロモーターが挿入されたpENTR-promoterプラスミドを作成する。＞【以下は方法２のプロトコール。】・増幅するためのプライマー＝primerA,primerBとする。primerAはプロモーターの5'端に対応する配列＋attB1の12塩基部分配列(AAAAAGCAGGCT)を5'側に付加する。primerBはプロモーターの3'端に対応する配列＋attB2の12塩基部分配列(AGAAAGCTGGGT)を5'側に付加する。・これらのプライマーを用いたPCRの際のアニーリング温度（プラスミドとハイブリダイズする部分のTm−5℃が標準）を"annealing-temperature"とする。標準のannealing-temperatureは50℃とする。プライマーを設計する際にはできるだけこの温度に合わせる。・プラスミド（プラスミドX）から増幅する場合、増幅される部分以外の位置でプラスミドXを１回切断する酵素＝制限酵素Aとする。・PCRにより増幅される長さ("product-length"(kb))を確認。PCRの際の"extension-time"(分)は通常"product-length"を切り上げた整数値にする。○＜プラスミドから増幅する場合のみ＞プラスミドXを制限酵素で切断する（"buffer"は制限酵素Aに適したものを使う。プラスミドおよび制限酵素の量は標準値を示す。）H2O39μl10×buffer5μlプラスミドX5μl(0.5～1μg程度)制限酵素A1μl(～10ユニット)計50μl↓37℃エアインキュベーターで１時間（以上）保温↓75℃のウォーターバスで15分間インキュベート↓すぐ氷で２～３分冷やす。↓50μlのTEを加える。↓○エタノール沈澱10μlの3MNaOAc(sodiumacetate;酢酸ナトリウム)(pH7.0)を加え、mixする。250μlのEtOH(ethanol；エタノール)(-20℃に冷えたもの)を加えてmixする。↓氷の上で15分静置。↓4℃で12000rpm×15分遠心液を吸って除く。70%EtOH(-20℃に冷えたもの)を加える。mixしない。↓すぐ4℃で12000rpm×2分遠心液を吸って除く。↓真空ポンプで減圧乾燥。15μlのTEを加えて溶解する。→保存は-20℃○１段目PCR:以下を氷で冷やしながらMix後、PCR機にかける。＜プラスミドから増幅する場合＞＜ゲノムDNAから増幅する場合＞H2O34.6μlH2O39.1μl10×PfxAmplificationbuffer6μl10×ExTaqbuffer6μl2.5mMdNTPs7.2μl2.5mMdNTPs7.2μl50mMMgSO41.2μl線虫ゲノムDNA(0.2μg/μl)5μlenhancersolution3μlprimerA(10μM)1.2μl制限酵素切断済みプラスミドX5μlprimerB(10μM)1.2μlprimerA(10μM)1.2μlTakaraExTaq(5units/μl)0.3μlprimerB(10μM)1.2μl計60μlPfxDNApolymerase0.6μl計60μl↓→10μlを別のチューブにとり、氷の上で保持（電気泳動用「増幅前サンプル」）。(PCR)95℃2'10cyclesof:(94℃15秒"annealingtemperature"30秒68℃"extension-time"分)4℃forever(PCR)95℃2'20cyclesof:(94℃15秒"annealingtemperature"30秒68℃"extension-time"分)4℃forever→5μlを増幅前サンプル5μlと並べて電気泳動して増幅を確認【バンドが薄かったらさらに5サイクル（上記A