会计学第一节动物细胞融合一、动物单个细胞的获得组织的获得组织的消化胶原酶消化（1）向培养瓶中放入1－5mm3大小的组织块，加5ml2000单位/ml的胶原酶干液，最终浓度为200单位/ml，pH=6.5。（2）36.5℃水浴4－48小时，无需摇动，中间可更换酶液一次。（3）当组织变软，分散于瓶底时，轻轻震荡即散成细胞团或单个细胞，小心倒出培养液。（4）800r/min离心5分钟，弃上清液，重新悬浮BSS溶液中，再离心一次。（5）加入培养液制成细胞悬浮液二、细胞融合的方法1．PEG诱导融合法操作步骤2．电融合电融合的优点电融合的基本过程3.病毒介导的融合影响细胞融合的因素三、杂种细胞的筛选动物细胞的筛选方式：2）营养互补筛选系统：细胞在缺乏一种或几种营养成分时，不能生长繁殖，即营养缺陷型细胞。利用两种亲本细胞营养互补作用原理可以筛选杂种细胞。亲本A：色氨酸缺陷型亲本B：苏氨酸缺陷型杂种细胞可以在不含色氨酸和苏氨酸的培养基上培养，而亲本细胞均会死亡。3）温度敏感突变型杂种细胞的筛选：一般的培养细胞能在32度到40度的范围内生长，但温度敏感突变型的细胞能在高温或低温下生长。由此筛选杂种细胞。亲本一：具有卡那霉素抗性但只能在37度左右生长。亲本二：高温敏感突变型，但不能抗卡娜霉素。杂种细胞能在高温和含卡娜霉素的培养基上生长。第二节单克隆抗体一、抗体的结构与功能1、抗原：进入动物体内对肌体的免疫系统产生刺激作用的外源物质。包括：蛋白质、多糖、核酸、病毒、细菌、各种细胞等。特点：外源性、结构性（分子表面具有稳定的环状结构基团作为识别位点）、特异性（抗原与抗体的反应）。2抗体动物免疫系统分泌的中和或消除抗原物质的影响的糖蛋白，存在于血清中，本质是免疫球蛋白（Immuniglobulin,Ig）。动物脾脏有上百万个B淋巴细胞，一个细胞就是一个克隆，它针对抗原上的一个抗原决定簇产生的抗体是单克隆抗体。一种抗原通常具有多个不同的抗原决定簇，因此能刺激多个B淋巴细胞产生相应的单克隆抗体，因此血清中的抗体是针对不同抗原决定族的单克隆抗体混合物，称为多克隆抗体。人体内的五种抗体二、单克隆抗体的制备亲本细胞的选择淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：体内法或体外法。体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。细胞融合HAT培养基筛选杂交瘤细胞细胞融合的选择示意图HAT选择系统杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT-或TK-亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。特异性杂交瘤细胞的筛选利用培养基对单抗进行鉴定的过程杂交瘤细胞的克隆化培养有限稀释法软琼脂培养法单抗的大规模生产三、单克隆抗体的改造和应用1、单抗作为体内体外诊断试剂2、单克隆抗体靶向制剂2）药物通过小分子与单抗连接通过一些小分子交联剂，把药物分子上的某些基团连接起来。小分子交联剂：如同型双功能试剂，包括戊二醛、顺乌头酸酐、马来酸酐、戊二酐；异型双功能试剂：N－琥珀酰胺基－3－丙酸和寡肽等。顺乌头酸酐制成的最常用，在中性条件下较稳定，在酸性条件下容易发生水解。这种靶向试剂与肿瘤的表面抗原结合后，会进入溶酶体，在酸性环境下释放药物，而杀死肿瘤细胞。3）药物通过大分子与抗体相连大分子聚合物：葡聚糖、多聚赖氨酸、多聚谷氨酸、聚合多肽和血清蛋白等。总之，利用单抗试剂合可以作为靶向药物，针对肿瘤、自身免疫系统疾病、各种病原体病等。3、杂交人－鼠单克隆抗体4、人源单克隆抗体5、抗体融合蛋白6、抗体酶