第四节基因的分离和获得目标基因克隆的三大战略：1.利用PCR技术或化学合成法体外直接合成目的基因，然后将之克隆、表达；2.构建感兴趣的生物个体的基因组文库或cDNA文库；3.利用基因差异表达获得目的基因。基因的分离和获得的常用方法一、基因分离的物理方法根据DNA分子的两条链存在着G≡C，A=T碱基配对。如DNA分子中某段的G≡C碱基对含量高，则其热稳定性就高，其溶解温度（Tm）就高。这样，人们通过控制溶解温度使富A=T区解链变性，而富G≡C区仍维持双链。当利用单链核酸酶S，酶去除解开的单链部分，得到富G≡C区的DNA片段。二、鸟枪法(Shotgun)又称霰弹法鸟枪法克隆目的基因的基本战略三、基因文库法构建基因文库的意义几个物种基因组大小及基因数目构建基因组文库应满足的条件例如，某一哺乳动物基因组G=3x109bp，以17kb的随机片段克隆构建的文库中，使任一给定DNA序列达99％的概率出现，则：N＝ln(1-0.99)／ln[1一(17x103／3x109)=8.1x105如果克隆片断长为20kb，则N=6.5X105果蝇的基因组约1.5X108bp，以20kb克隆时，N=4X105基因组文库的构建DNA不完全酶解用DNA的随机片断克隆法来：机械剪切和部分酶切DNA分子的物理剪切运用识别4对碱基的限制性内切酶制备随机性DNA片断，具有了较高的随机性，但相对随机性更高的方式还是运用不依赖碱基序列的物理剪切方法。DNA分子的物理剪切可以采用DNA溶液的小孔喷射、超声波处理和高速搅拌等几种方式。选择合适的构建基因组文库的载体：1）要求有较大的克隆容量；2）要求在置于宿主中扩增时有较高而均等的转化效率；3）在重组子进行扩增时，扩增的机会相近；4）可以较方便地进行文库的筛选。基因组文库构建的常用载体：Lambda噬菌体载体、cosmid、BAC及YAC。（三）载体制备（四）重组连接制备出的适当大小随机性基因组DNA与载体左臂右臂进行连接，实现左臂—插入分子—右臂的分子重组。构建文库时重组连接常采用相同粘性末端的连接，以替换型载体构建基因组文库多采用BamHI酶切末端与插入外源DNASau3AI末端的互补连接。（五）噬菌体离体包装：（六）重组噬菌体转染大肠杆菌其他载体文库的构建1.粘粒载体文库2.酵母人工染色体文库（yeastartificialchromosome,YAC）:与YAC载体配套工作的宿主酵母菌带有一个赭石突变ade2。带有这个突变的酵母菌在基本培养基上形成红色菌落，当带有赭石突变抑制基因sup4的载体存在于细胞中时，可抑制ade2-1基因的突变效应，形成正常的白色菌落。无义突变：由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变。其中密码子改变为UAG的无义突变又叫琥珀突变，密码子改变成UAA的无义突变又叫赭石突变。细菌人工染色体（BacterialArtificialChromosomesBAC）细菌人工染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上构建的，命名为pBACs，其装载量范围在50-300kb之间。携带一个Cmr，严谨型复制子oriS,解旋酶基因repE,确保低拷贝质粒精确分配至子代细胞的基因座parA,parB,parC及多克隆位点重组分子导入受体细胞以Lambda噬菌体载体和cosmid载体构建的重组分子在体外包装成噬菌体颗粒，通过感染细菌的方式将重组分子导入受体细胞。以酵母人工染色体和细菌人工染色体载体构建的重组分子采用电激转化法将重组分子导入受体细胞。基因组文库的扩增筛选1.文库的扩增lambda载体的基因组文库是以噬菌斑的形式获得重组噬菌体的集合；cosmid载体的基因文库是存在于细菌中的大分子重组质粒，以独立的转化菌落形成集合；BAC文库也是以细菌菌落形式存在；YAC文库则以酵母菌形式出现。噬菌体文库的扩增可以通过感染宿主，每一噬菌斑便是一个重组噬菌体扩增后的产物。用缓冲液将这些噬菌斑中的病毒洗脱下来，便获得了扩增后的文库。离心除出细菌碎片等杂质后，上清液加1-2滴氯仿，置于40C可以保存数年。粘粒载体、BAC和YAC文库，则对转化的菌落单独编号、扩增和保存。2.文库的筛选染色体步移(chromosomewalking)当基因的位置已知，但没有可用的探针，只知道同一染色体上的另外一个已经克隆的基因，就可以通过染色体步移方法克隆所需的基因。其基本原理是用探针筛选文库，得到阳性克隆后，将这个重组载体中的插入片段分离出来，然后用这个片段的末端部分(注意不能包含重复序列)作为新一轮筛查文库的探针；得到新的重组载体中的插入片段，同上一个插入片段的末端部分(即探针序列)是重叠的，共有的。也就是这两个片