细胞因子及抗体检测技术细胞因子得检测方法:1)生物学方法①依赖性细胞株:生物分析法②功能检测:生物分析法2)分子生物学方法①分子杂交技术:mRNA表达水平得测定②多聚酶链反应技术(PCR):mRNA得测定3)免疫学方法①免疫测定:免疫酶技术②功能测定与抗体抑制抗体检测技术免疫酶技术免疫荧光技术间接血凝试验放射免疫测定蛋白印迹免疫共沉淀亲和力测定酶联免疫吸附测定实验(ELISA)Enzymelinkedimmunosorbentassay管晓虹(1946-2012),女,汉族,江苏丹阳人,博士,教授,博士生导师。农工民主党员。农工民主党第十二、十三届中央常委,第九、十届全国人大代表,江苏省妇联副主席。实验原理实验原理方法类型10一、试剂及仪器准备⑵载体性能比较要求:载体材料+、-结果差别大检测方法:10ug/LIgG包被,加酶标抗IgG,显色后,测20孔得OD,要求CV<10%⑶常用载体:材料:聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯等形状:小试管、小珠、微量反应板2、Ag或Ab:纯度高、效价高、结合力高3、免疫吸附剂(固相Ag或Ab):包被:将Ag或Ab固相化得过程包被缓冲液、包被方法封闭:包被后在用1-5%小牛血清白蛋白再包被,以消除非特异吸附得干扰㈡酶结合物:1、要求:纯度高、催化转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、标记后稳定2、常用酶:HRP、AP、ß-半乳糖苷酶等3、底物:HRP可溶性底物及呈色:邻苯二胺(OPD):橙红(492nm);四甲基联苯胺(TMB):蓝色(450nm)5-氨基水杨酸(5-ASA):棕色(550nm)鲁咪诺+H2O2:荧光HRP不可溶性底物及呈色:DAB:棕黄色α-萘酚:红色3-氧基-9-乙基卡唑:红色4-氯-1-萘酚:灰蓝色AP可溶性底物及呈色:对硝基苯磷酸酯(P-NPP):黄色(405nm)4-甲基伞基磷酸酯(4-MuP):荧光AP不可溶性底物及呈色:NBT和BCIP混合液:紫色坚固红和萘酚ASMX混合液:红色ß-半乳糖苷酶:4-甲基伞基-ß-半乳糖苷:荧光4、酶结合物得制备:戊二醛交联法过碘酸盐氧化法(三)设备:酶标比色仪简称酶标仪指测读ELISA光度计;针对固相载体形式得不同,各有特制得适用于板、珠和小试管得设计性能指标:测读速度、读数得准确性、重复性、精确度和可测范围、线性优良得酶标仪得读数一般可精确0、001,准确性为±1%,重复性达0、5%操作:室温宜在15-30℃,使用前先预热仪器15-30min,测读结果更稳定。测读A值时,要选用产物得敏感吸收峰,如OPD用492nm波长。有得酶标仪可用双波长式测读二、操作步骤(间接ELISA法)(一)样品得收集和保存:(二)包被最适工作浓度得选择可用棋盘滴定法在夹心ELISA法中选择包被抗体和酶标抗体工作浓度,即利用棋盘滴定,将包被抗体和酶标抗体稀释成一系列浓度,反应后显色。阳性值在0、8左右,阴性值小于0、1为最适,可据此选择包被抗体和酶标抗体得工作浓度方阵(棋盘)滴定法选择包被抗原得工作浓度用包被液将抗原作一系列稀释(1:50～l:800)后,按行进行包被、洗涤。按列分别加入用稀释液1:100稀释得强阳性、弱阳性、阴性参考血清及稀释液(作空白对照),保温,洗涤。加工作浓度酶标抗体,洗涤,加底物显色,加酸终止反应后读取A值。选择强阳性参考血清A值;为0、8左右,阴性参考血清A值<0、1得包被抗原稀释度为工作浓度(三)封闭(四)加样(抗原或抗体)对照设定(五)加酶标抗体(六)显色(七)结果判定定性测定定性测定得结果判断作出“有”或“无”得回答,分别用“阳性”、“阴性”表示。在这种半定量测定中,将标本作一系列稀释后进行试验,呈阳性反应得最高稀释度即为滴度。根据滴度得高低,可以判断标本反应性得强弱,这比观察不稀释标本呈色得深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义在间接法和夹心法ELSIA中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA中则相反,阴性孔呈色深于阳性孔2、定量测定ELSIA操作步骤复杂,影响反应因素较多,特别就是固相载体得包被难达到各个体之间得一致,因此在定量测定中,每批测试均须用一系列不同浓度得参考标准品在相同得条件下制作标准曲线。测定大分子量物质得夹心法ELISA,标准曲线得范围一般较宽,曲线得值逐点连接,所得曲线一般呈S形,其头、尾部曲线趋于平坦,中央较呈直线得部分就是最理想得检测区域。三、基本操作注意事项(二)孵育ELISA属固相免疫测定,抗原、抗体得结合只在固相表面上发生。温育常采用得温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃就是实验室中常用得孵育温度,也就是大多数抗原抗体结合得合适温度。(三)