种子罐灭菌及上罐方案一、设计背景种子罐是在扩大培养（中试放大）中用来提供发酵菌种的设备，而在发酵培养过程中最重要的一门技术就是无菌技术，发酵最忌讳的就是染菌，因为染菌很大意义上等于白做。制药行业采用多种消毒和灭菌方法，有：热压灭菌法，湿热灭菌法，滤过灭菌法及气体灭菌法等;经过比较几种方法的优劣并结合实际采用湿热灭菌法对种子罐进行消毒灭菌微生物生长需要补充碳源和氮源及某些微量元素（镁离子、钙离子、磷元素等等），而用到这些微量元素的是菌体，菌体经过一级培养基和二级培养基的培养后，种子液的菌体浓度就达到了上小试的标准，但要上中试那么这个浓度未免也低了点，然而种子罐的出现解决了这个问题，种子罐将种子液进行一定程度的培养，达到上罐浓度之后再提供给主发酵罐作为上罐初始浓度进行全过程培养，进行升转，升气，补料，诱导等操作，使得下罐发酵液不仅需要菌体浓度达到一定的量，且下罐收率也得达到目标要求，更何况蛋白表达量和活性测试，更是作为两项重要数据。而想达到以上的要求，那么作为基本中的基本，菌体种子液这一块就是不能出问题的，因为在实际工作中，种子罐和其他补料罐的添加及灭菌基本上在两天之内就要搞定，做好上罐的准备，主发酵罐的发酵培养基更是需要提前配好，万一种子罐灭菌不彻底，导致种子液在初始培养期间染菌，那么物料的损失就不止一个种子罐，还会影响到整个项目进程，给公司带来损失，这是全公司各个部门都不想看到的。本方案旨在解决种子罐的灭菌不完全，和上罐操作不规范的问题。二、设计依据湿热灭菌法是指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡，所以该法的灭菌效率比干热灭菌法高，是发酵生产过程中最常用的灭菌方法。该方案依据珠海冀百康生物科技有限公司的湿热灭菌SOP设计而来，参照行业标准和企业标准共同制定。三、设计方案（一）本工艺方案的技术工艺流程图图1.种子罐灭菌及上罐工艺流程图（二）工艺执行方案1.设备使用前检查（1）检查气源是否正常供气。（2）检查蒸汽是否正常供应，蒸汽若超过5天未使用，应对蒸汽管道进行排污处理，处理次数不少于三次。（3）检查自来水能够正常供应。2.空气过滤器消毒（1）打开蒸汽进气阀，打开净化蒸汽进气阀，打开净化蒸汽过滤器排污阀进行排污，待排污口流出为蒸汽时开始计时，5min后调节排污阀使得有少量蒸汽吹出即可。（2）关闭空气进气阀。（3）打开蒸汽进气阀，打开蒸汽排污阀进行蒸汽冷凝水排污，直至吹出的是蒸汽。打开空气过滤排污阀门，使空气过滤器排污阀有少量蒸汽吹出。若初始阶段吹出的蒸汽含水量较多，应增加阀门开度，使冷凝水吹出，保证蒸汽排污阀和空气过滤器排污阀吹出的为饱和蒸汽。（4）打开阀门空气排污阀，关闭排污阀空气进气阀。（5）控制蒸汽进气阀开度，使空气过滤器压力缓慢上升到灭菌压力，到达压力后开始灭菌（6）空气过滤器灭菌时间为30min,期间保证灭菌温度不低于121度。（7）灭菌结束后，关闭净化蒸汽进气阀。（8）用净化压缩空气吹干空气过滤器吹干30min以上，达到常温即可。吹干期间空气过滤器压力不能调零，保压待用。3.种子罐灭菌（1）加入纯化水冲罐。（2）检查拧紧罐上阀门，关闭罐底阀。关闭自来水进水阀和自来水回水阀。（3）投料按照发酵培养基配比表进行投料，投入的物料之和比规定投入量少两升，开搅拌。（4）打开夹套蒸汽进气阀使蒸汽进入夹套，打开夹套排污阀进行夹套排污。（5）打开种子罐排气阀。（6）打开底阀蒸汽进气阀，打开底阀排污阀使冷凝水排出。（7）开始夹套升温，待温度上升到80℃，关闭电机，停止搅拌。（8）待温度上升到90℃-100℃，关闭夹套蒸汽进气阀，停止夹套升温。（9）打开罐底阀(3/4开度)，保证罐底阀有蒸汽流通，使罐内液体翻滚。开始蒸汽进罐。（10）打开排污阀进行排污，保证排污阀和罐底阀排污阀有蒸汽流通。（11）罐压到达灭菌压力0.1MPa以上，温度到达121℃开始灭菌计时，灭菌时间不少于30min。（12）灭菌结束后，关闭罐底阀，微开底阀排污口后迅速关闭，关闭罐底阀蒸汽进气阀。（13）打开空气进罐阀门，通入无菌空气。（14）待温度下降到115℃，打开自来水进水阀，打开自来水回水阀，夹套进自来水（15）关闭排污阀。甘油补料罐降温。温度低于80℃时，打开电机，开始搅拌。（16）温度到达工艺要求温度后，关闭自来水进水阀,关闭自来水回水阀。（17）关闭排气阀，关闭空气进罐阀门，种子罐保压备用。4.种子移液管灭菌（1）打开种子罐罐底阀蒸汽进气阀，打开底阀排污口，排除冷凝水，收小底阀排