第五章细菌基因重组及遗传分析第一节转化（Transformation）感受态的出现DNA在进入感受态细胞之前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。可逆吸附的DNA对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不可逆吸附DNA对DNA酶不敏感。吸附到细胞表面是双链DNA，而不是单链DNA流感嗜血菌特异性摄取序列：5’AAGTGCGGTCA3’淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：5’GCCGTCTCAA3’在流感嗜血菌的染色体上有600个拷贝的摄取序列。摄取序列虽然只有10-12bp，但很少随机地出现在其他物种的DNA序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。转化为相同或相近物种之间的同源重组提供了可能性，是自然界中基因交换的一条重要途径，在生物变异和进化中起着重要作用。二、人工转化1970年Mandel和Higa首先发现DNA在含有高浓度Ca2+的条件下能够被受体细胞摄入和转化，随后的实验证明由Ca2+诱导的人工转化的大肠杆菌中，其转化DNA必须是一种独立DNA复制子。先将大肠杆菌培养至OD600=0.5～1接着用50-100mmol／LCaCl2处理制备成感受态细胞然后将DNA与感受态细胞混合在冰浴中反应20-40min进行42℃热击可增加DNA的吸收（107个转化子/ug质粒DNA）PEG介导的转化电脉冲法（电穿孔法）基因枪(biolistic)转化三、建立转化方法的策略四、转化应用2.遗传图谱的绘制3.基因中断4.插入基因第二节接合作用（conjugation）混合培养后在基本培养基中出现的原养型菌落是否是杂交的结果？必须要排除下列几种解释：一是细菌细胞并没有接合，而是交换了DNA(转化作用)二是细胞并未接合，而是通过培养基交换了养料(互养)三是细菌细胞并未接合而是亲本发生了回复突变当时Lederberg和Tatum已经证明，当把A菌株的培养液经过灭菌，再加入到B菌株的培养液中，没有原养型菌落，这说明上述实验并非转化的结果。1950年，Davis通过他的U形管试验进一步支持了Lederberg和Tatum的结论。营养缺陷型细胞通过培养基交换养料而生长的现象亦称为互养。因为大肠杆菌的突变率一般都<10-8，若两个基因同时回复突变，则其可能性只有<10-16（10-8×10-8），这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培养能出现10-5~10-6频率的菌落一定是重组的结果。4.遗传物质的单向转移把A菌株认为是供体，而B菌株是受体A菌株作为遗传物质的供体，当链霉素对它进行灭活以后，并未影响它传递遗传物质的能力。B菌株作为遗传物质的受体，一旦被链霉素杀死以后，必然不能出现重组体。StrrA突变型（不育变种）⊙①大肠杆菌的供体或雄性细胞(如A菌株)记为F+，带有一个性因子或致育因子F(fertilityfactor)，而另一个不带性因子F的受体或雌性细胞(如B菌株)叫做F-；②杂交F+×F-是可育的，杂交F-×F-是不育的；③F因子可以传递，从F+到F-细菌，但必须通过细胞接触④F因子能够自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从另一个F+细胞再把它传递过来。F因子是染色体外的一种遗传结构，也就是质粒(plasmid)。二、F质粒的结构及其在细胞中的存在状态长度为33kb，由23个基因组成，构成一个tra操纵子(traoperon)。traABCEFGHKLQUVW与性菌毛的形成有关traYZMIGD等与F因子的转移有关traG、traN影响杂交对的配对形成与否traI、traM决定DNA转移起始traI编码解旋酶I(helicaseⅠ)traD控制DNA转移；traY、traZ编码的核酸内切酶能在转移起始区oriT上切开一个缺口。复制区负责F质粒的自我复制F质粒自主复制区为oriV（Vegetativeoriginofreplication），在oriV中包含有复制起点。F质粒的复制是按θ型方式进行复制，它是一种严紧型质粒。F质粒的拷贝数能被精确地控制，一个寄主细胞约有1~2个F质粒。rep（Freplicativeprotein）编码一组与F质粒复制相关的蛋白质。inc（incompatibility）基因产物使细胞具有不相容性。F质粒插入区包含4个插入顺序：2个IS31个IS21个Tn1000（γδ）它们与F质粒的整合、切除、易位有关2.F质粒在细胞内的存在形式三、F质粒与接合作用2.Hfr×F-杂交3.F’×F-杂交四、中断杂交试验和基因定位0thrlactrphisthyargstrFPeptide-inducedtransferofEnterococcusfaecalisplasm