第十五章基因技术1基因工程2分子杂交3聚合酶链反应4DNA序列测定5转基因动物6基因剔除技术7克隆动物8基因诊断和基因治疗第一节基因工程（一）重组DNA技术（recombinantDNAtechnology）是指在体外按人们的意愿将不同的DNA分子重组的技术。是指利用重组DNA技术将目的基因和载体重组，再导入受体细胞内进行扩增和表达的过程。是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。基因工程相当于目的基因的无性繁殖过程，也称其为基因克隆(genecloning)。(一)工具酶(二)载体（一）工具酶1．限制性内切酶(restrictionendonuclease)命名：第一个字母代表细菌的属名，用大写；第二、三个字母是该细菌种名，用小写；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。限制性内切核酸酶Ⅱ型限制酶识别序列特点———回文结构EcoRⅠHpaⅡ—GAATTC——GTTAAC——CTTAAG——CAATTG——G—CTTAA粘端切口平端切口2.其他相关酶类T４多核苷酸激酶能催化ATP的γ-磷酸转移到DNA或RNA的5‘端羟基上。碱性磷酸酶简称AKP，此酶能特异的切除DNA或RNA5‘端的磷酸产生5’端羟基以防止载体的自身连接。末端脱氧核苷酸转移酶能催化单核苷酸转移到DNA的3‘端的羟基上。（二）载体1.质粒（plasmid）pBR322质粒基因工程中使用的质粒具备的特点头部3.粘粒(cosmid)：4.病毒（virus）三、基因工程的操作过程（一）目的基因的获得将某种生物的基因组DNA切割成一定大小的片段，分别与适合的载体重组后导入宿主细胞，这些重组分子中插入片段的总和可代表该生物全部基因组序列。这种通过重组、克隆方法保存在宿主细胞中的各种DNA重组分子的集合体称为基因组DNA文库。构建基因组DNA文库的过程（二）目的基因与载体的连接1.同源粘性末端连接2.平端连接3.定向连接目的基因与载体的连接（三）重组体导入受体细胞（四）基因工程菌的筛选pBR322质粒—双抗生素抗性bla=氨苄青霉素抗性基因Ori=复制起始点lacZ’=β-半乳糖苷酶N端编码序列质粒pUC18--蓝白菌落筛选标记●●●●●●z（五）外源基因的表达2.真核表达体系优点：重组质粒转染的细胞具有遗传的稳定性和可重复性哺乳动物细胞能对外源基因转录的hnRNA剪切加工成成熟的mRNA对表达的蛋白质能进行转录后的加工如糖基化可将表达产物分泌到培养基中方便下游的提纯基因工程的操作过程第二节核酸分子杂交（nucleicacidhybridization）一、核酸探针（probe）核酸分子与探针杂交探针标记方法（一）同位素探针：32P:常用，灵敏度高，半衰期短，穿透力强3H：分辨力高，半衰期长，适合原位杂交35S:标记蛋白，也可用S取代磷酸中的O(二)光敏物质dNTP（三）地高辛（四）分子信标：荧光标记二、分子杂交的方法提取DNA或RNA，直接点在硝酸纤维素膜上，和探针杂交检查有没有目的DNA或RNA。SlotblotDNA点阵:将多种探针序列成排的点在硝酸纤维素膜上，检测DNA或RNA和那一个探针杂交。待检样品进行标记一种样品多种探针基因芯片：将更多的探针排列在硅片上，借助计算机检测未知的DNA或RNA和哪一个探针杂交。基因芯片（二）原位杂交1.组织切片或细胞涂片原位杂交：将DNA或RNA在组织切片和细胞涂片中变性和固定，和探针杂交，确定DNA或RNA在组织和细胞中的定位。2.菌落或噬菌斑原位杂交：基因工程中筛选阳性克隆。3.转移印迹技术：Southernblotting:检测DNANorthernblotting:检测RNAWesternblotting:检测蛋白质，因要用抗体检测，也叫免疫印迹（Immunoblotting）在众多样品中哪一个是目的DNA、RNA或目标蛋白质。三种印迹技术的比较第三节聚合酶链反应（PolymeraseChainReaction,PCR）PCR技术是1985年由美国科学家Mullis建立，荣获1993年诺贝尔化学奖。PCR反应第一次循环二、PCR体系的基本成分三、PCR的基本反应步骤（一）DNA的微量分析（二）目的基因的克隆（三）测定基因的表达水平（四）基因的定点突变PCR技术是生命科学领域中的一项革命性创举和里程碑。广泛应用于临床医学、遗传咨询、司法鉴定、考古、工业、农业及分子生物学等各个领域第四节DNA的序列分析(DNAsequenceanalysis)DNA序列分析的基本原理1.