二、蛋白质功能的全新设计蛋白质的功能设计蛋白质修饰的化学途径蛋白质修饰的分子生物学途径氨基的化学修饰羧基的化学修饰氧化和还原反应化学修饰影响的条件化学方法：产生半合成的结构，一个天然多肽与一个人造（或化学修饰）的多肽相缔合非共价缔合产生二硫键形成肽键产生非天然型的共价键非共价缔合在多肽链中如果出现一个切口，但多肽链并不因此分开，仍能保持其生物学活性。在变性系统中，破坏非共价键后，在非变性基质中仍可形成原来的构型，活力也随之恢复。这一现象可用来产生半合成的类似物产生二硫键二硫键被还原剂打开，多肽彼此分开DTT、二硫苏糖醇将这些片断与适当的被修饰的或合成的另一肽相混合，通过重新形成二硫键而形成嵌合分子形成肽键通过酶连接反应形成肽键从猪胰岛素生产人胰岛素将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白酶）通过酶法与活性酯偶联羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子产生非天然型共价键利用双功能试剂可以将不同的蛋白质连在一起。常用的方法是将双功能的接头与两个蛋白质分子中的赖氨酸残基侧链相连接。可以用主链肟键产生尾-尾相连二聚体如：抗体制备具有不同功能的F（ab)2的类似物蛋白质改造的分子生物学方法突变：寡核苷酸介导的定向突变、PCR方法、盒式突变定向进化：异错PCR、基因家族改组技术表达体系原核表达：大肠杆菌真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞定位突变：在已知DNA序列中取代、插入或缺失一定长度的核苷酸片断优点：突变率高、简单易行、重复性好应用：研究基因的结构与功能的关系；蛋白质结构与功能，读基因调控机理、疾病的病因和机理方面研究应用：寡核苷酸介导的定点突变、PCR方法介导的定点突变及盒式突变随机突变优点：在体外模拟自然进化的过程常用手段：易错PCR、基因家族改组技术（DNAfamilyshuffling)等寡核苷酸引物介导的定点突变寡核苷酸引物介导的定点突变的改进基于抗生素抗性“回复”的突变方法PCR方法介导的定点突变盒式突变3种方法优缺点比较蛋白质定向进化定向进化技术定向进化的原理易错PCR技术(error-pronePCR)DNA改组(DNAshuflling)：由美国Stemmer于1994年首次提出一项体外重组技术随机引发重组(RPR)1998年,Arnold提出了一种有效的新方法交错延伸技术(StEP)：由Zhao等提出,是一种简化的DNAshuffling技术易错PCR（errorpronePCR）是指在扩增目的基因的同时引入碱基错配，导致目的基因随机突变连续易错PCR(sequentialerrorpronePCR)策略。即将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱变DNA改组和外显子改组体外随机引发重组交错延伸定向进化的筛选策略通过酶促反应的特征加入底物显色荧光共振能量转移同位素标记底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测定向进化与自然进化的异同点定向进化技术目标酶Figure1TheroutineofstaggerextensionprocessFigure11StrategyoftheconstructionoftherecombinantFigure12Strategyofselectionoftherecombinantplasmid基因融合融合基因的构建的方法载体为pCYBtRNA接到的非天然氨基酸掺入外源蛋白表达体系原核表达体系酵母表达体系表达载体的表达宿主细胞蛋白质修饰的化学途径蛋白质修饰的分子生物学途径形成肽键通过酶连接反应形成肽键从猪胰岛素生产人胰岛素将B链丙氨酸残基改为苏氨酸残基（胰蛋白酶）通过酶法与活性酯偶联羟基琥珀酰亚胺酯作为接头分子蛋白质改造的分子生物学方法突变：寡核苷酸介导的定向突变、PCR方法、盒式突变定向进化：异错PCR、基因家族改组技术表达体系原核表达：大肠杆菌真核表达：酵母、昆虫、哺乳动物细胞寡核苷酸引物介导的定点突变的改进3种方法优缺点比较通过酶促反应的特征加入底物显色荧光共振能量转移同位素标记底物通过检测底物消耗或产物生成进行终点检测tRNA接到的非天然氨基酸掺入