菠萝蛋白酶得提取、初步分离纯化及活性测定14食安(1）班杨泽杰摘要:本文结合考马斯亮蓝G２50染色法，研究了不同纯化方法，包括硫酸铵沉淀法、透析法，对菠萝蛋白酶活性得影响。实验结果表明,两种纯化方法都能有效纯化菠萝蛋白酶,但就是会对菠萝蛋白酶得活性造成一定得损失.关键词：菠萝蛋白酶沉淀法透析法纯化酶活性前言菠萝蛋白酶（Brｏmelａin，EC3、４、２2、3）简称菠萝酶,就是从凤梨属植物菠萝中提取得一组复合得半胱氨酸巯基蛋白水解酶,它广泛存在于菠萝得果实、芽、叶、茎。菠萝蛋白酶属于糖蛋白，就是由巯基蛋白酶与非蛋白酶组分构成得复杂复合物,因含有一个不稳定得游离巯基,所以菠萝蛋白酶极易被氧化而使其酶活下降。菠萝蛋白酶得相对分子质量大约为3３00０,等电点9、55，最适pH在７、1左右，在偏酸环境下酶活下降较快,碱性环境能延缓失活。菠萝蛋白酶得温度得最稳定范围就是55℃～６5℃。金属盐离子中NaＣl、KCl对酶活得影响不就是很大，维生素C、半胱氨酸、硫代硫酸钠、2-巯基乙醇就是菠萝蛋白酶得稳定剂,EDＴA能通过螯合对酶活有影响得金属离子而保护菠萝蛋白酶，有机溶剂中甲醇、乙醇、乙二醇对酶活损失较大。在食品工业中菠萝蛋白酶作为一种食品添加剂，能分解蛋白质、肽、酯与酰胺等,可用于肉质嫩化、水解蛋白、啤酒澄清、干酪生产等。在医药上它可以治疗水肿及多种炎症，它能帮助迅速结痂，对正常组织无害，不影响植皮，适用于中小面积深度烧伤得治疗.１实验材料与仪器实验材料与试剂1、1、1实验材料新鲜菠萝(3个），透析袋１、1、2实验试剂(１）盐析粗提液0、1mo1／LpＨ7、8磷酸缓冲液配制(ＰBS)(配４000mL）,0、0１ｍo1/LｐＨ7、８磷酸缓冲液配制(PBS)（配40０0mＬ）(２)酶活力测定试剂１％酪蛋白(进口分装）(配100mL),激活剂［含２０mｍo１/L半胱氨酸—盐酸盐、1ｍmo１/LEDTA-Na2(乙二胺四乙酸二钠)]，10％三氯乙酸（TＣA)实验仪器与用品实验仪器HJ－6多头磁力搅拌器：常州国华电器有限公司ＭＣ-H18Ｓ012多功能红外炉：广东美得生活电器制造有限公司DS-１高速组织捣碎机:上海标本模型厂ＧKC1１0Ｒ2可控硅恒温水浴锅：赏花锦屏仪器仪表有限公司TD5M低速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司TDＬ—６0B台式离心机:上海安亭科学仪器厂７22型可见分光光度计:上海舜宇恒平科学仪器有限公司UV51０0B型紫外可见分光光度计:上海元析仪器有限公司PL1502-S电子天平:梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司BS110Ｓ分析天平北京赛多利斯天平有限公司ＢCD—５39WT冰箱：青岛海尔股份有限公司实验用品(１)以组为单位得用品大试管18mm×20０ｍm（10支）、试管架（2个）、烧杯（50mL×1，１00mＬ×2，2０0ｍL×1)、滴管（2支）、玻璃棒（２支）、移液管（5mＬ×１，１mL×2，0、1mL×1，0、2mＬ×1）、漏斗（３个)、量筒（1０0ｍL×1)、研钵、白瓷板、纱布、滤纸、蒸馏水瓶、洗耳球、标签纸、橡皮筋。（2）全班共用得用品试剂瓶（1０0０mL×7，25０mL×３，６0ｍL×２0）、烧杯（10０0ｍL×４)、塑料烧杯(2000ｍＬ×2）、量筒(500mL×2，1０0０mL×２)、广泛ｐＨ试纸、剪刀、电炉与锅、蒸馏水容器、透析袋(截留相对分子质量8000~14000）。实验方法菠萝蛋白酶得粗酶提取称取菠萝皮材料３０g，将菠萝皮在清水中洗净,沥干,切成小段后置于超高速搅拌机中，加入约6０ｍＬ预冷得0、１ｍｏ1/LｐＨ7、8PBS，持续搅拌10~15min至粉碎，搅拌完成后用4层纱布过滤，得到滤液后，用冷冻离心机于４°C3０００rpm离心6min,弃沉淀，即得到菠萝蛋白酶粗提液,测定粗提液得体积、蛋白质含量与酶活性[１］.盐析根据附录得“硫酸铵饱与度计算表”，按30％硫酸铵饱与度计算在上述酶提取液中需添加得固体硫酸铵量，称取固体硫酸铵于研钵中，研磨呈粉末,慢慢小量分次向酶提取液中添加固体硫酸铵，边加边搅拌，使溶液最终硫酸铵饱与度为３０%,放置于冰水混合物（4℃)3０mｉn后,酶蛋白沉淀析出，4°Ｃ4000ｒpm离心1０ｍin,收集沉淀，加入0、1mo１/LpH7、8PBS约1５mL至完全溶解，测定其体积、蛋白质含量与酶活性［2］.透析将溶解液装入2、5cm×8cm透析袋（预先将透析袋在蒸馏水中煮沸30mｉｎ)中，于500ｍL烧杯中,在磁力搅拌器搅拌下用蒸馏水透析，15ｍin换水一次，换水3～4次后，检查SO4２—就是否已被除净(检查得方法就是：取２ｍLBaCｌ2溶液放入一支试管，滴加2～3滴透析外液至试管中，若出现白色沉淀，表示SO４