第四章酶的提取与分离纯化本章学习目标和要求根据酶本身的特性，在分离纯化工作中必须注意下列问题:（2）防止酶的变性失活破碎细胞的条件要尽可能地温和；要避免和防止过酸、过碱、重金属离子、变性剂、去污剂、高温、剧烈的机械作用和自身毒素等诸多因素；低温和洁净的环境必不可少；尽早尽可能多地去除各种杂质、脂类、核酸及毒素；使用极性条件要以目的蛋白质的活性和功能不受损害为原则。（3）缓冲溶液操作缓冲溶液中的物质成分要谨慎考虑，避免随意性;除去对可溶性及缓冲容量的考虑之外，蛋白水解酶和核酸酶抑制剂、抑制微生物生长的杀菌剂、稳定蛋白质构象和酶活性的还原剂及金属离子等均应依不同蛋白质和酶的性质、结构予以周全考虑。（4）检测手段建立灵敏、精确、特异的检测手段是评估纯化方法、判断目的蛋白质产率、活性、纯度的前提。酶活性检测可根据特异性底物的反应；免疫学检测方法等（5）纯化策略的选择应该选择不同机制的分离单元（方法）组成一套工艺；应将含量多的杂质先分离去除；应尽早采用高效分离手段；将最昂贵、最费时的分离方法放在最后阶段。Contentsofchapter4第一节酶的提取、分离纯化技术路线第二节酶溶液的制备一.材料预处理及细胞破碎不同的生物体或同一生物体的不同部位的组织,其细胞破碎的难易不一,使用的方法也不相同。机械破碎1）捣碎法利用捣碎机高速旋转叶片所产生的剪切力将组织细胞破碎。一般用于动物组织，植物肉质种子，柔嫩的叶，芽等材料的破碎。3）匀浆法（homogenization）1）压力差破碎法通过压力的突然变化，使细胞破碎的方法称为压力差破碎法。高压冲击法、突然降压法（如：爆破性减压法）、渗透压变化法2）温度差破碎法利用温度的突然变化，由于热胀冷缩的作用而使细胞破碎的方法称为温度差破碎法。反复冻融多次,由于细胞内形成冰粒使剩余胞液的盐浓度增高而引起细胞溶胀破碎。在实际操作中要注意避免高温引起酶的变性失活!3）超声波破碎法（Ultrasonication）1）有机溶剂有机溶剂可以便细胞膜的磷脂结构破坏，从而改变细胞膜的透过性，使胞内酶等细胞内物质释放到细胞外。应低温操作，以防止酶变性失活。如甲苯、丙酮、丁醇、氯仿等。2）表面活性剂：表面活性剂可以和细胞膜中的磷脂以及脂蛋白相互作用，使细胞膜结构破坏，从而增加细胞膜的透过性。一般采用非离子型的表面活性剂。如Triton,Tween等。自溶法：将细胞在一定的pH值和温度条件下保温一段时间利用细胞本身酶系的作用，使细胞破坏，而使细胞内物质释出的方法，称为自溶法。外加酶制剂法:G+细菌----肽多糖----溶菌酶酵母----β-葡聚糖---β-葡聚糖酶霉菌----几丁质----几丁质酶纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶混合使用对植物细胞具有良好的破碎效果。价格高，通用性差，产物抑制的存在。各种破碎方法的评述高压均浆和珠磨两种机械破碎方法，处理量大，速度非常快，目前在工业生产上应用最广泛。但在机械法破碎过程中，容易产生大量的热量，使料液温度升高，而易造成生化物质的破坏，特别是在超声波处理时。因此，超声波振荡法主要适用于实验室或小规模的细胞破碎。非机械法一般仅适用于小规模应用。渗透压冲击和冻结－融解法都属于较温和的方法，但破碎作用较弱它们常与酶解法结合起来使用，提高破碎效果。（一）酶提取的方法（二）影响酶提取的主要因素盐溶现象/盐析现象用于提取在低浓度盐溶液中溶解度较大的酶。一般采用稀盐溶液进行酶的提取，浓度一般控制在0.02~0.5mol/L。常采用等渗溶液，即0.125mol/LNaCl和0.02~0.05mol/L（pH7.0~7.5）磷酸缓冲液或0.1mol/LTris-HCl。必要时，缓冲液中可加入EDTA（1~5mmol/L）、巯基乙醇（3~20mmol/L）等。例：酵母醇脱氢酶用0.5mol/LNa2HPO4溶液提取。6-磷酸葡萄糖脱氢酶用0.1mol/LNa2CO3溶液提取。枯草杆菌碱性磷酸酶用0.1mol/LMgCl2溶液提取。例：胰蛋白酶可用0.12mol/L的硫酸溶液提取一些和脂类结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的酶难溶于水,稀盐,稀酸,或稀碱中,常用不同比例的有机溶剂提取。如植物种子中的酶，一般用70%~80%的乙醇来提取。动物细胞微粒体中的酶用正丁醇来提取。常用的有机溶剂：乙醇、丙酮、异丙醇、正丁酮等,这些溶剂可以与水互溶或部分互溶,同时具有亲水性和亲脂性。例：琥珀酸脱氢酶、胆碱酯酶、细胞色素氧化酶等，用丁醇提取，都取得良好效果。1、温度酶的溶解度和稳定性与pH值有关.首先考虑酶的稳定性,提取溶剂的pH应在酶的稳定范围内；其次应远离等电点。为了提高酶的溶解度，提取时pH值应避开酶的等电点。在提取操作时适当加入底物或辅