分子克隆技术克隆（Clone）是指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。分子克隆（MolecularCloning）是指由一个祖先分子复制生成的和祖先分子完全相同的分子群。DNA克隆：将编码某一多肽或蛋白质的基因（外源基因）组装到细菌质粒（质粒是细菌染色体外的双链环状DNA分子）中，再将这种质粒（重组质粒）转入大肠杆菌体内，这样重组质粒就随大肠杆菌的增殖而复制，从而表达出外源基因编码的相应多肽或蛋白质。由于质粒具有不相容性，即同一类群的不同质粒常不能在同一菌株内稳定共存，当细胞分裂时就会分别进入到不同的子代细胞中，所以来源于一个菌株的质粒是一个分子克隆，而随质粒复制出的外源基因也就是一个分子克隆。（一）质粒DNA的制备质粒是存在于细菌染色体外的能独立复制的双链闭环DNA分子，它能赋予细菌（宿主细胞）某些特定的遗传表型。质粒并非细菌生长所必需，但由于其编码一些对宿主细菌有利的酶类，从而使宿主细菌具有抵抗不利自身生长的因素如抗药性等的能力。目前发现的质粒主要分为F质粒（性质粒），R质粒（抗药性质粒），E.coli质粒（大肠杆菌肠毒素质粒）。根据质粒在一个细胞周期内产生拷贝的数量，可将质粒分为严紧型（低拷贝，复制1-2次）和松弛型（高拷贝，复制10-200次）。由于质粒的不相容性细菌经分裂后就只留下了拷贝数较高的一种质粒，例如R1和R2两种抗药性质粒同属于一类，由于不相容性使它们不能共存于同一细菌中，但不同类群的质粒可以在一个细菌中共存。质粒存在于细菌中，所以制备质粒DNA时，首先应将含有质粒的细菌在含有相应抗生素的液体培养基中生长至对数期,使质粒在细菌中得到扩增。通过离心收集细菌，经碱裂解细菌，使质粒和细菌染色体DNA变性，然后再加中和液，使溶液PH值恢复到中性，这样质粒DNA又可以复性至天然双链构象状态，而细菌染色体DNA不能或很难复性所以仍处在变性状态，这些变性的染色体DNA与变性蛋白质缠绕在一起，易被离心去处，而质粒DNA仍存在于水相中，再用无水乙醇沉质粒DNA，最后经离心即可得到质粒DNA。（二）DNA插入片段的制备：目前有几种方法，如限制性内切酶直接分离法、文库筛选法、体外扩增法、人工合成法等，下面以逆转录-DNA聚合酶链式反应为例介绍获得外源基因DNA插入片段的方法。1、逆转录反应：所谓逆转录，就是以mRNA为模板合成一条互补DNA链(即cDNA)的过程，在逆转录反应中所用的是逆转录酶，即以RNA为模板的DNA聚合酶，它也具有5′-3′DNA聚合酶活性，在合成新的核苷酸链时也需要引物。由于真核基因组DNA，由内含子和外显子组成，内含子不编码蛋白质，因此体外扩增基因组DNA会给某些研究造成困难，以mRNA为模板的基因扩增可避免这种问题的发生，因此从某种意义上来说，逆转录反应更具实用性。制备cDNA时，首先要从细胞中提取mRNA，以mRNA为模板，在mRNA的poly(A)尾上结合12-18个寡聚（dT）片段作为合成的起始引物，在逆转录酶的作用下合成第一条cDNA链。然后用RNA酶消化DNA-RNA杂交链中的RNA，剩下的单链DNA的3′端往往有自发回折形成的发夹结构，正好可以作为合成第二条DNA链的引物。第二条DNA链的合成可以用DNA聚合酶Ⅰ，也可以用逆转录酶。双链DNA合成后，用S1核酸酶切去发夹结构，即获得平端的双链cDNA。2、DNA聚合酶链式反应（PCR）PCR技术是在模板DNA、引物和4种脱氧核糖核酸存在下，DNA聚合酶催化的一种体外酶促反应。PCR技术的特异性取决于引物和模板DNA结合的特异性。反应由三个步骤组成：1、变性：通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链DNA解离成单链DNA；2、退火：当温度突然降低时，使含量远远多于模板DNA的引物与模板DNA在局部形成杂交双链；3、延伸：在4种dNTP底物和Mg2+存在的条件下，DNA聚合酶由5'-3'方向合成新的与模板DNA互补的DNA链。以上反应为一个循环，通常进行25-30个循环，由此介于两个引物之间的特异性DNA片段得到大量复制，数量可达2×107-8拷贝。PCR引物决定PCR的特异性，引物的设计就显得尤为重要。下面以已知DNA序列设计引物为例介绍设计引物应考虑的几个方面：1、GC比值：众所周知,碱基对中的GC之间有三条氢键，AT之间有两条氢键，GC和AT在引物序列中的合理比例是设定PCR中退火温度的重要依据。通常在一个引物中GC和AT各半即可2、长度：通常15-20bp即可。由于目的不同，有时引物长些，但太短会影响引物的特异性。3、方向：设计出的引物永远是5'-3'方向,所以正向引物是与一股模板DNA序列相一致的，而反向引物则与这股模板DNA序列相互补。4、酶切位点：如果想克隆所放大的D