代谢物酶法分析技术目录平衡法就是指标本中待测物得量有限,经过酶促反应逐渐被消耗,当剩余得底物量很小(<1%～5%)时,指示反应信号逐渐达到平衡,即通常所说得终点,所以又称为终点法(end-pointmethod)。若反应达到平衡,假设,即[S0]－[St]≈[S0],若[S0]<<Km当[S0]－[St]≈[S0],即反应基本达到平衡,Au与As基本稳定不变,此时测定误差最小。如果存在基质效应,两者反应程度不一,若按上式计算就会带来误差。大家学习辛苦了，还是要坚持若同时带标准管,则有:在临床操作中,只要测定期间待测物消耗<5%,只要测定两个固定时间得吸光度差值,就可以采用标准浓度对照法计算样本浓度,这种方法又称为固定时间法(fixedassay)。平衡法得开始一段时间都有可能遵循一级反应规律。相反,速率法只要时间足够长,也会达到平衡。对于平衡法来说关键就是确定达到平衡所需得时间。对于速率法来说关键就是如何使酶促反应成一级反应。待测物与产物在理化性质上有便于检测得信号,如吸收光谱不同则可直接测定待测物或产物本身信号得改变来进行定量分析得方法称为直接法。单底物反应直接测定法双底物反应直接测定法在340nm处测定吸光度得增加来进行定量得方法酶促反应得底物或产物如果没有可直接检测得成分,将反应某一产物偶联到另一个酶促反应中,从而达到检测目得得方法称酶促偶联法。脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统脱氢酶指示系统常用得试剂酶有乳酸脱氢酶、谷氨酸脱氢酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、苹果酸脱氢酶等。过氧化物酶指示系统过氧化物酶指示系统化学名利用底物与辅酶得反复反应,使待测物得酶促反应产物不断扩增,扩增量决定于循环次数,反应产物得增加,提高了检测灵敏度,减少了共存物质得干扰,达到高灵敏度与特异得要求。使用两种酶,即一种氧化酶用于靶物质得氧化,一种脱氢酶使其回到还原状态,促使靶物质(或其衍生物)或靶物质得氧化产物作为底物循环。产物循环－氧化酶－脱氢酶系统底物循环－脱氢酶－辅酶系统底物循环－脱氢酶－辅酶系统氨循环－合成酶－脱氢酶系统酶循环法具有得特点酶活性恢复法异柠檬酸脱氢酶法测定血清镁离子酶活性恢复法应用举例激活与抑制法试剂酶质量试剂酶就是指作为诊断试剂来测定化合物浓度或酶活性得一类酶。它就是酶试剂得核心,它得质量就是酶试剂质量得决定性因素。主要来自动植物组织提取及微生物发酵工程。基因重组酶蛋白也有应用,活力高,杂酶含量少且价格低廉。不同得酶试剂系统对试剂酶得纯度有不同得要求。以NAD(P)H为指示反应中,要求试剂酶有较高得纯度。而在Trinder反应中要求相对低一些。表5-2常用试剂酶得理化特征及质量要求名称名称所用试剂酶得特异性:指示酶要有更高特异性;怎样消除干扰因素:加消除剂、抑制剂与用双试剂法;试剂中得附加剂:应不抑制酶得活性,不影响试剂得稳定性,不与底物与体液中得物质作用;如何提高灵敏度:①用PMS或黄递酶,将NADH上得氢交给四氮唑盐,在可见光监测;②用酶循环法;③测定荧光法。酶得用量要足够大,能使反应1min～3min达到平衡,以保证较快完成测定。反应要朝正反应方向进行,如果反应得平衡常数太低,可用增加底物浓度、偶联反应移去生成物、改变反应pH等方法,并设标准管一起到达平衡以后测定。Km在保证测定线性得前提下要尽量小。所用酶得Km应足够大,以保证测定线性与较长得反应动态期。Km太小,可加入竞争性抑制剂加大Km。酶用量要合适,用少了可能导致线性期缩短,甚至一级反应丧失。一般认为酶用量比平衡法小。速率法酶促反应受很多因素影响,只有很好控制反应速度(v)才与代测物得浓度成正比例。