教学目的要求：1.掌握酶和酶作用的底物、酶标记的抗体或抗原；熟练掌握固相载体。2.熟练掌握酶免疫技术的分类3.熟练掌握酶联免疫吸附试验的方法类型及原理4.掌握酶免疫测定的应用放射免疫技术基本原理基本原理一、酶和酶作用底物辣根过氧化物酶（HRP）DH2+H2O2→→→D+2H2O邻苯二胺OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。（二）碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AP)（三）β-半乳糖苷酶（β-galactosidase，β-Gal）二、酶标记抗体或抗原（一）酶标记抗体或抗原的制备制备方法（二）酶标记物的纯化与鉴定2.酶标记物的鉴定三、固相载体（一）固相载体的要求（二）固相载体的种类（三）包被与封闭以聚笨乙烯固相载体（如制ELISA板）为例说明免疫吸附的过程：抗原（抗体）→用PH9.6的碳酸盐溶液稀释→4ºC过夜→用10%的小牛血清再包被一次，以消除固相载体表面未吸附的位点，此过程叫做封闭。23一、均相酶免疫测定法一、均相酶免疫测定法二、异相液相酶免疫测定法第三节酶联免疫吸附试验（ELISA）二、方法类型及反应原理（1）将已知抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）加待检标本,温育，洗涤。（3）加酶标抗体，洗涤。（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。2.双位点一步法检测抗原如果待检标本中抗原浓度过高，容易形成“钩状效应（hookeffect）”。钩状效应严重时，可出现假阴性结果，必要时可将待检标本适当稀释后重新测定。3.竞争法检测抗原酶标抗原（1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。（2）待测管中加待检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，待检标本中如果含有抗原，则与酶标抗原竞争固结合相抗体，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。对照管中只加酶标抗原，温育，洗涤。（3）加底物显色。对照管中颜色深，待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。（二）检测抗体的方法2.双抗原夹心法4.加酶作用的底物不显色3.竞争法检测抗体（1）竞争法检测HBcAb：①将HBcAg包被于固相反应板上，洗涤。②加入待检标本和酶标特异性抗体，温育，洗涤。③加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。3.加酶作用的底物显色（2）竞争法检测HBeAb：①将HBeAb包被于固相反应板上，洗涤。②加入待检标本和HBeAg，温育，洗涤。③加入酶标HBeAb，温育，洗涤。④加入底物，温育，形成有色产物，用酶标比色仪测定结果。显色深浅与待检标本中相应抗体含量成反比。4.捕获法5.加酶作用的底物不显色方法评价试剂盒（图为瑞士HAMILTONFAME24/20全自动酶免分析仪）1．病原体及其抗体测定广泛应用于传染病的诊断。2．蛋白质测定各种免疫球蛋白、补体组分、肿瘤标志物各种血浆蛋白质、同工酶等。3．非肽类激素测定如T3、T4、雌激素、绒毛膜促性腺激素、黄体素、胰岛素、皮质醇、促甲状腺素等。4．药物和毒品测定如地高辛、苯巴比妥、庆大霉素、吗啡等。小结展望练习1.用于标记的HRP的RZ值应该大于A.2.4B.3.0C.1.5D.3.5E.5.01.用于标记的HRP的RZ值应该大于BA.2.4B.3.0C.1.5D.3.5E.5.02.RZ表示A酶活性B.催化效率C.标记率D.酶纯度E效价2.RZ表示DA.酶活性B.催化效率C.标记率D.酶纯度E.效价3.HRP与底物TMB反应后的测定波长为A.278mmB.450mmC.403mmD.495mmE.492mm3.HRP与底物TMB反应后的测定波长为BA.278mmB.460mmC.403mmD.495mmE.492mm5.HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈A.蓝色B.橙黄色C.棕黄色D.黄色E.紫色5.HRP与TMB反应后，加H2SO4终止反应前呈DA.蓝色B.橙黄色C.棕黄色D.黄色E.紫色6.辣根过氧化物酶（HRP）的受氢底物为A.OPDB.TMBC.DABD.H2O2E.Eu6.辣根过氧化物酶（HRP）的受氢底物为DA.OPDB.TMBC.DABD.H2O2E.Eu7.ELISA常用的固相材料为A.NC膜B.聚苯乙烯C.磁性颗粒D.尼龙膜E.凝胶7.ELISA常用的固相材料为BA.NC膜B.聚苯乙烯C.磁性颗粒D.尼龙膜E.凝胶8.目前国内ELISA常用的酶是A.HRPB.APC.β-GalD.OPDE.TMB8.目前国内ELISA常用的酶是AA.HRPB.APC.β-GalD.OPDE.TMB9.何种