第三节重组DNA药物优点：1、可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽；去除内源性物质的不足之处2、提供足够数量的生理活性物质，以进行生理生化、结构的研究3、利用基因工程技术可发现、挖掘更多内源性生理活性物质4、获得新型化合物主要基因工程产品的研制、开发、上市时间DNA重组药物制造的主要步骤二、基本过程1、目的基因的获得4、PCR法或逆转录PCR（RT-PCR）典型PCR反应包括①模板变性94℃以上（1～2′）②退火50～55℃（1～2′）③延伸72℃（1～2′）在高温聚合酶作用下，以DNA单链为模板，由引物起始从5′→3′延伸。化学合成法在已知DNA序列或多肽的一般结构时，如链长在60bp～100bp可用化学合成法直接合成DNA。2、基因表达优点：易大量生产，成本低，周期短缺点：多为胞内表达、提取困难，易生成包含体、含起始密码Met(AUG)，有内毒素毒性真核酵母：研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物；基因组小，仅为大肠杆菌4倍；传代时间短；无毒；有分泌功能和修饰功能；已用于干扰素、乙肝表面抗原等重组DNA药物的生产。丝状真菌：有很强的蛋白质分泌能力，能正确加工，糖基化方式与高等生物相似，有成熟发酵和后处理工艺哺乳动物细胞：类似天然产物，但培养条件苛刻大肠杆菌与真核细胞表达系统比较大肠杆菌表达的重组蛋白易形成包含体蛋白质复性概念2）、表达载体要求：a、能独立复制b、有灵活的多克隆位点和方便的筛选标记c、具有有效运载外源基因的能力，能携带大小不同的外源基因d、容易控制，在细胞内稳定性高，安全可靠。如大肠杆菌的pBV220系统，为温度诱导表达载体，已成功用于IL-2，IL-3，IFN等pET系统，最有潜力的系统，可用乳糖代替IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖），产物可达细胞总蛋白20~30%，表达量可达总蛋白50%。pET载体3）、构建工程菌目的基因与载体DNA的连接重组DNA向宿主细胞内转移筛选与鉴定带有目的基因的阳性克隆影响目的基因表达的因素三、重组药物的分离纯化◎针对不同的产物表达形式采取不同的策略采用分泌型战略表达重组蛋白，通常体积大、浓度低，因此应在纯化之前采用沉淀或超滤等方法先进行浓缩处理；采用包涵体型战略表达重组蛋白，应先离心回收包涵体；采用融合型战略表达重组蛋白，一般是胞内可溶性的，拟首先选用亲和层析进行纯化表达在细胞膜和细胞壁之间的间隙中的蛋白质，应用低浓度的溶菌酶处理，然有再用渗透压休克法释放重组蛋白。◎针对不同性质的重组蛋白选择不同的层析类型等电点处于极端区域（大于8或小于5）的重组蛋白应首选离子交换法进行分离，这样很容易除去几乎所有的杂蛋白；重组蛋白特异性的配体、底物、抗体、糖链等都是首选亲和层析纯化方法的重要条件，原则是它们与目标蛋白之间的解离常数应在合适的范围内（10－8～10－4mol/L）;疏水层析和反相层析是根据蛋白质的疏水性差异进行分离的；凝胶过滤层析是根据蛋白的分子量和体积差异进行分离的；径向层析是近年来发展起来的集层析分离和膜分离于一体的一种复合技术，在流量、负荷量等参数方面显示出极大的优越性。◎合适分离纯化介质的选择常用的蛋白质分离纯化介质有Sephadex和Sepharose。理想的分离纯化介质应具有下列性质：＃对目标蛋白具有较高的分辨效率＃对目标蛋白不会造成变性＃化学性能和机械性能稳定，重复性好＃价格低廉◎分离纯化过程的规模化蛋白质分离纯化的实验室工艺、技术、方法在大规模产业化过程未必合适，如：＃实验室方法在工程上可能难以实现（超声波破细胞壁）＃实验室方法在大规模生产中可能成本过高（超速离心）因此，在很多情况下，实验室的技术路线不等于生产工艺。四、质量控制保证编码DNA序列正确要了解以下特性：A、目的基因来源、克隆过程、序列B、表达载体名称、结构、遗传特性及酶切图谱、抗生素标记等C、宿主名称、来源、传代历史、检定结果及生物学特征D、载体引入宿主方式、及载体再宿主中状态E、插入基因于表达载体两侧控制区核酸序列F、启动和控制克隆基因表达的方法及水平种子克隆纯而且稳定，在培养工程中工程菌不应出现无突变或质粒丢失的现象种子批系统工作细胞库1）、产品的鉴别氨基酸组成分析：肽图分析：N末端和C末端氨基酸测序：蛋白质二硫键的分析：重组蛋白相对分子量：等电点的测定：2）、纯度分析：SDS-PAGE,CE,IEF,HPLC3）、生物活性测定4）、残余杂质检测宿主细胞蛋白含量、宿主细胞DNA、残余抗生素等5）、安全性检测无菌实验、热原实验、毒性实验、免疫原性检查五、重要的重组DNA药物1）、干扰素（IFN-α、β、γ）1957年Isaccs等发现