重组人源化抗BTLA单克隆抗体培养与收获方案一、设计背景抗体依据其特性与特异性蛋白受体结合，从而发挥一系列生理作用从而起到药物的治疗作用，随着生产技术的进步，单克隆抗体凭借其高效、高产量、特异性强等特性而得到推广，如今单抗类药物被广泛应用与肿瘤、病毒感染、自身免疫类疾病，在生物医药领域的作用愈发凸显。工业上通过大规模细胞培养，从而使大量的单克隆抗体得以产出。在细胞培养的工艺设计中，首先要保证能够持续并稳定的表达出质量合格、性质稳定的产物，其次因为商品生产的需要应当兼顾生产效率和效益，最后必须确保产品的安全性和有效性，生产过程遵循GMP的要求设计并实行。如今的单克隆抗体已然成为最大的一类生物制品尤其是因其在抗肿瘤领域的广泛应用而获得了发展。目前上市的诸如利妥昔单抗、曲妥珠单抗、贝伐单抗等均取得了巨大的市场收益。而根据单抗的技术发展来看，单抗产品从鼠源单抗、嵌合单抗、人源化单抗发展到如今逐渐占主导地位的全人源化单抗。单克隆抗体是具有单一特异性的抗体，可与特定受体结合产生作用，根据疾病的特性和治疗策略设计了不同种类的单抗用以实现高效特异性的治疗效果，在单克隆抗体的设计源于实验室内的动物细胞杂交实验，最初的产品为鼠源单抗，由于免疫反应的作用，会对人体产生副反应和免疫排斥等，故而单抗向着人源化的方向发展至今，以消除免疫原性和副反应。二、工业化大规模培养中的工艺设计在工业化生产中，须根据GMP的要求设计生产工作流程，各个工艺过程需要设计构建相应的洁净区环境。上游细胞培养工艺包括种子细胞复苏、种子细胞摇瓶扩增、种子细胞反应器扩增、生产罐培养、收获以及培养基和其他溶液的配制。细胞培养过程中，摇瓶和种子罐中培养的细胞称为种子，通过传代次数表示种龄，细胞每扩增一次即传代一次。同时在进入生产罐培养前种龄不宜过高，通常为传代6次。之后将符合要求的种子细胞转入生产罐培养。种子细胞复苏是从细胞库中取出种子细胞，解冻后将其转移至培养基中培养，之后通过摇瓶逐级放大扩增培养，此工作在环境级别为C级洁净区的种子培养间进行，工作过程为无菌操作且在A级层流保护下进行。种子间完成种子液制备后，便将种子液接种至50L反应器中培养，之后的培养过程在细胞培养间进行，环境级别为D级洁净区，之后扩大至500L反应器，最后是2000L生产罐培养。2000L生产罐接种后，通过控制工艺参数，并流加补料培养基和葡萄糖，以最大程度积累满足质量标准的目标产物，待培养至10～14天时进行收获，采用蝶式离心加深层过滤的方式对收获液进行澄清，经澄清后的上清液进入下游蛋白纯化阶段。三、具体工艺方案（一）流程概况种子复苏与种子反应器生产罐摇瓶扩增扩增培养培养培养基及其收获他溶液配制（二）细胞培养基及上游溶液配制1．培养基的种类基础培养基，即为提供细胞生长提供所需的基本原料和环境的培养基，目前通常使用商品化的培养基干粉配制。补料培养基，在2000L反应器大规模培养阶段时，为反应器中补加必要原料而配制的培养基。2．其他溶液包括NaHCO3溶液、葡萄糖溶液、PBS溶液等。其中NaHCO3溶液、葡萄糖溶液用于2000L生产罐培养阶段，PBS溶液用于收获阶段。3．培养基的配制分别为种子培养阶段、50L反应器阶段、500L反应器阶段、2000L生产罐阶段配制基础培养基。配制前先确认操作区域处于清洁有效期内，且没有与本产品相关的产品、文件以及物料存在，设备仪表处于验证、计量有效期内，操作区域状态标识已包含本次生产内容，培养基配制罐处于保压及CIP有效期内。其次按照批生产记录进行培养基及其他溶液的配制。控制pH、温度、转速等参数在规定范围内，将配制所需物料根据程序提示投入配制容器之中，定容后取样检测，检测渗透压、pH、细菌内毒素是否在可接受范围，除菌过滤，避光保存，供细胞培养阶段使用。最后在本批次生产结束后，进行清场：清理本批次的批生产记录，废液、废物，清理操作区域。（三）种子复苏与摇瓶扩增培养种子细胞复苏是从细胞库中取出种子细胞，解冻后将其转移至培养基中培养，之后通过逐级放大的摇瓶扩增培养，先从培养基接种至125ml摇瓶培养（S1阶段），再到1L摇瓶扩增(S2阶段），最后到3L摇瓶扩增(S3阶段）。在S2、S3两个阶段，当细胞达到扩增要求时，便可将种子液转移至下一扩增阶段。种子液进入50L反应器培养阶段，即S4阶段时，要求检测活细胞密度和细胞活率，达到要求方可进行转种操作。此工作在环境级别为C级洁净区的种子培养间进行，工作过程为无菌操作且在A级层流保护下进行，所有接触活细胞的容器使用后和废弃的活细胞需要进行灭活处理。（四）50L种子反应器扩增培