细菌的涂片标本制作及革兰染色技术一、实验目的1.掌握细菌染色标本的制备技术。2.掌握革兰染色法及其结果判断。3.熟悉革兰染色法在鉴定细菌上的重要意义。二、实验原理细菌染色法是细菌形态学检查的一项基本技术。由于细菌个体微小，无色半透明，在普通光学显微镜下不易清晰观察，一般需经染色来增加反差，从而有利于细菌标本的观察。染料有带阴离子着色基团的酸性和带阳离子着色集团的碱性燃料。在一般生理条件下（ph7.4左右），细菌菌体都带负电荷，故用于细菌染色的染料多为带阳离子这色基团的苯胺染料，如美蓝、结晶紫、碱性复红等，它们较易与细菌菌体结合。革兰染色的原理目前存在三种假说。1）通透性学说：革兰阳性菌细胞壁结构较致密，肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入；革兰阴性菌细胞壁结构疏松，肽聚糖层薄，含大量脂质，乙醇易渗入。2）等电点学说：革兰阳性菌等电点（pl2--3）比革兰阴性菌（pl4--5）低，在相同pH条件下，革兰阳性菌所带负电荷比革兰阴性菌多，故与带正电荷的结晶紫染料结合牢固，不易脱色。3）化学学说：革兰阴性菌菌体含大量核糖核酸镁盐，可与碘、结晶紫牢固结合，使已着色的细菌不被乙醇脱色；革兰阴性菌菌体含核糖核酸镁盐很少，故易被脱色。革兰（Gram）染色法是细菌学中最常见的一种鉴别染色法。用本法不仅可以观察细菌的形态和排列方式，还可以根据染色结果将所有细菌分成革兰氏阳性菌核革兰氏阴性菌两大类；不被酒精脱色仍保留紫色者为革兰氏阳性菌，被酒精脱色后复染成红色者为革兰氏阴性菌。革兰氏染色法不仅有助于细菌的鉴别，同时还为分析细菌的致病性和选用抗菌药物提供了依据。在细菌标本染色前，必须将细菌固定在载玻片上，常用的固定方法为加热法，其目的是杀死细菌，且保持原有形态，并使细菌黏附在载玻片上，不致染色时脱落。实验试剂与仪器1、菌种：大肠杆菌的18-24h琼脂斜面培养物一支2、试剂：革兰氏染色液（结晶紫、碘液、95%乙醇、稀释石碳酸复红各一瓶）3、其他：显微镜、载玻片、生理盐水、接种环、酒精灯等。四、实验步骤1、涂片：取洁净的载玻片一张，滴一小滴生理盐水于载玻片中央。将接种环在酒精灯火焰上灭菌冷却后，从琼脂斜面上沾取少许菌苔混入载玻片上的生理盐水中，磨匀并涂抹成直径1.5mm左右的均匀薄层菌膜。将接种环灭菌后放回原处（如用菌液制作图片，则不加生理盐水，直接用接种环取菌液涂抹于载玻片上）。亦可在同一载玻片上，用特制蜡笔划分为二格，每格涂抹一种细菌。2、干燥：将上述涂片置于桌子上，在室温下让其自然干燥；或将涂有细菌的一面朝上，在酒精灯火焰上方慢慢烘干，但切勿靠近火焰，防止细菌烤焦或玻片碎裂。3、固定：手持玻片一端，涂有细菌标本的一面朝上，将载玻片在酒精灯火焰外层来回快速通过3次，使涂抹的细菌固定在载玻片上。固定时，温度不能太高，以手背皮肤触及载玻片时不感觉过烫为宜，千万不得使载玻片停留于火焰上灼烤。4、染色1）初染：将载玻片置于染色架上，加结晶紫染液2-3滴于标本片上，使染液布满涂片的范围，作用1min后细流水冲洗，并将标本片上的残水摔静。2）媒染：滴加卢戈碘液2滴，作用1min后细流水冲洗，并将标本片上的残水甩静。3）脱色：加95%乙醇数滴滴于标本片上，频频摇晃35s后，斜持玻片使乙醇流掉，再滴加乙醇直至无紫色液体脱下为止（约30s），细流水冲洗，甩去标本片上的残水。4）复染：滴加稀释复红染液，作用30s后细流水冲洗，用吸水纸吸干。在涂片处滴加一滴香柏油，用油镜观察，并判断菌体的染色性，记录实验结果。实验完毕后，擦镜纸擦干镜头，整理、清洁显微镜，把显微镜放回原处，把标本片放回指定的污物缸内。五、实验结果将本次实验实验结果记录在表中。菌名染色结果（2）任选一种菌，绘制染色图。