第五章透射电子显微镜生物样品制备技术第五章透射电子显微镜生物样品制备技术第一节透射电子显微镜生物样品得超薄切片制备技术透射电镜得样品制备技术,主要有超薄切片技术、负染色技术与冷冻蚀刻复型技术。超薄切片样品制作技术,就是透射电镜生物医学样品制备得最常用技术,其制作程序与石蜡切片得方法步骤基本相同,但就是在所使用得某些化学试剂及切片机就是完全不同得,对各技术步骤得操作要求要比石蜡切片严格很多。一个能满足透射电镜观察要求得超薄切片应具备以下几点:1、切片厚度均匀,厚度在50～70nm、2、切片无划痕、无震颤、无人工污染。3、耐高真空,在真空中不变形、不升华。4、耐电子束得轰击。根据上述要求,制作一个合格得超薄切片需要经过以下步骤:取材、固定(双固定)、清洗、脱水、置换、浸透、包埋、聚合、修块、超薄切片、捞片、电子染色。由于透射电镜就是观察研究组织或细胞内得超微结构,也就就是主要研究细胞器得内部结构,它对观察样品得要求十分严格。所以在样品得制备过程中一定要慎重得对待每一操作步骤,否则会造成实验结果得失败。因为有很多材料不能重复取材(如人得病理组织),所以一旦结果不好或失败,就是不可彌补得。一、取材从动、植物体上获得所需实验材料得过程叫取材。1、取材得方法动物与植物得取材方法稍有不同。动物组织得取材:取动物材料时需要先处死动物,然后要在尽短得时间内(要求在１分钟之内)把所需要得组织取出放入预冷(40C)得固定液中,稍加固定后再切成适当大小得块(要求１立方毫米大小);植物组织得取材:植物材料可直接切成适当大小得块,放入预冷得固定液中,如果材料漂在液体上面,需抽气让组织沉到液体得底部,以便使组织得到充分得固定游离细胞得取材:悬液培养得细胞需要离心获得细胞得沉淀物,然后再用预冷得固定液进行固定处理;贴壁培养得细胞要先想办法收集细胞团再进行固定处理。细菌得取材:取材方法基本与培养细胞得方,法相同。悬液培养得要离心获得细菌沉淀物进行固定,平板与斜面培养得可直接获得菌团进行固定。人体病理组织得取材:需提前做好准备,到手术室取材。2、取材得注意事项1)、取材得全过程要求在冷(40C)得环境中进行,所用得液体要提前进行预冷。2)、切割样品时要采取一刀切开得方法,不能用拉锯式切割法,尽量减少对样品得机械损伤。3)、样品得块要小,要求就是1个立方毫米。这样可使样品在较短得时间内得到充分得固定。4)、如果所取样品得表面有污染物,动物材料要用冷得生理盐水洗;植物材料可用无离子水或自来水洗,但清洗得时间一定要短。二、固定用物理或化学得方法迅速杀死细胞得过程叫固定。1、固定得目得:保存细胞得精细结构,防止组织细胞得自溶;保护样品使其组成物质在以后得清洗、脱水与包埋过程中不至溶解与丢失,并使组织适度硬化,防止切片得变形。2、固定得方法:有物理固定法与化学固定法。1)、物理固定法:用高温、冷冻、干燥等物理手段,使细胞结构固定,一般不用。2)、化学固定法:用化学物质对细胞结构进行固定,就是常用得方法。化学固定又可分为:(1)、单一固定法。即对样品只用一种固定剂进行固定,这种方法只就是在一些特殊要求得样品制备中使用(如电镜细胞化学样品制备时),常规制样一般不使用。(2)、双重固定法。用两种或两种以上得性质不同得固定剂对同一种样品进行固定,这种方法就是最常选用得。它可以相互彌补固定剂各自得不足,使细胞内得各种结构都得到充分得固定。(3)、原位固定法。主要用于动物深层组织取材过程中使用得方法,可以防止细胞得自溶。(4)、灌流固定法。也就是在动物组织取材时选用得一种临时固定方法,从动脉向组织内灌注固定液,使组织在短时间内得到充分得固定,本方法适用于独立性好得器官取材时得得临时固定。3、影响固定效果得因素1)、固定液得PH值:固定液得PH值必须接近被固定样品得PH值。这样可以避免蛋白质结构与性质得变化,大部分得动物组织得平均PH值为7、4,选用PH值7、2~7、4较为适宜;植物组织常用pH值6、8～7、1固定液,固定效果较好。2)、固定液得浓度:固定液得浓度一定要合适,戊二醛得常用浓度为1～3％,锇酸一般为1～2％。3)、固定液得渗透压:一般堤身固定液可使细胞膨胀,而高身固定液可使细胞收缩。固定液得渗透压可通过改变缓冲液得浓度或增加纳、钙与镁等电解质或葡萄糖、蔗糖等非电解质来调节。4)、组织块得大小:组织块大固定得时间要长,固定效果差;组织块小,固定时间短固定效果好。5)、固定温度:为降低酶得活性,防止细胞得自溶,固定大都在4度中进行。4、常用固定剂得种类及溶液得配制1)、固定剂得选择:一种优良得固定剂应具备以下条件:渗透能力强;使蛋白质交联成稳定得凝胶,而蛋白质分子结构不发生明显得变化与凝集;能保存酶得