实验四细菌的接种培养法与生长现象的观察【目的和要求】1．掌握无菌技术，建立无菌观念；明确无菌操作时注意要点。2．掌握细菌的接种、分离培养方法和接种环的制作方法。3．熟悉细菌生长现象的观察方法。【试剂与器材】1．菌种：葡萄球菌、链球菌、大肠埃希菌、枯草芽胞杆菌等。2．培养基：固体、半固体、液体培养基。3．其他：温箱、酒精灯、接种环、接种针、L形玻棒、打火机、记号笔等。【实验内容】一、细菌的接种工具1．接种环和接种针：其结构包括环（针）、金属柄、绝缘柄三部分（见图4-1）。其中环（针）部分最佳材料为白金丝，因其受热和散热速度快，硬度适宜，不易生锈且经久耐用，但因为价格昂贵而限制了其应用。目前实验室常用的是经济实用的300~500W电热镍鉻丝。一般要求接种环长5~8cm，直径为2~4mm，定量接种环的容量为0.001ml。图4-1接种环和接种针接种环（针）在使用之前需检查镍鉻丝是否呈直线，若有弯曲，需用吸管或接种环的另一端将其压直；若环不圆，可将镍鉻丝前端放在吸管尖部缠绕一圈，再将镍鉻丝突出的部分朝内压紧。接种环用于固体、液体培养基的接种，接种针用于半固体培养基的接种。2．L形玻棒：由直径2~3mm的玻璃棒弯曲成L形制成。在使用之前用厚纸包扎后置高压蒸汽灭菌，或沾取无水乙醇后在火焰上烧灼灭菌。主要用于液体标本涂布接种。二、细菌的接种方法1．液体培养基的接种该法主要用于细菌的增菌培养或进行细菌的生化反应。方法：（图4-2）（1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许细菌。（2）左手拿试管，右手持接种环，用右手其余手指将试管塞打开，试管口通过火焰烧灼灭菌。（3）将接种环在贴近液面的管壁上上下碾磨数次，使细菌均匀分布于培养基中。（4）将试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。（5）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。图4-2液体培养基接种法2．半固体培养基的接种该法可用于保存菌种、观察细菌的动力或进行细菌的生化反应。方法：（图4-3）（1）先将接种针在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。（2）左手拿试管，右手持接种针，将试管塞打开后，试管口通过火焰灭菌，将接种针从培养基的中心向下垂直穿刺接种至试管底上方约5mm处（勿穿至管底），然后由原穿刺线退出，（3）将试管口灭菌后加塞，接种针烧灼灭菌后放回原处。（4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。1/5图4-3半固体培养基接种法3．平板划线接种法该法可将标本中的多种细菌分散成单个菌落，有利于细菌的分纯和进一步鉴定。方法：（1）连续划线法（图4-4）1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。2）左手斜持平板，用手掌托着平板底部，五指固定平板边缘，在酒精灯旁以拇指、食指和中指将平板盖撑开大约30~45°角，将已挑取细菌的接种环先在平板一侧边缘均匀涂布，然后运用腕力将接种环在平板上自上而下，来回划线。划线要密，但不能重叠，充分利用平板的面积，不能划破琼脂表面，并注意无菌操作，避免空气中的细菌污染。3）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。4）在平板底上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。图4-4固体培养基连续划线法（2）分区划线法（图4-5）1）先将接种环在火焰上烧灼灭菌，待冷却后挑取少许菌落。2）同上法将平板盖打开约30~45°角，将已挑取细菌的接种环在平板一端（1区）内作来回划线，再在2、3、4区依次划线，每区的划线须有数条线与上区交叉接触，每划完一区是否需要烧灼接种环依标本中的菌量多少而定，每区线间需保持一定距离，线条要密而不重复。3）划线完毕，将平板扣入平板盖，接种环烧灼灭菌后放回原处。4）在平板底上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。图4-5固体培养基分区划线法4．斜面培养基接种法（图4-6）斜面培养基主要用于细菌的纯培养，以进一步鉴定细菌或保存菌种。（1）将接种环（或接种针）在火焰上烧灼灭菌，待冷却后以无菌操作挑取少许菌落。（2）左手拿试管，打开试管塞后，试管口通过火焰灭菌，再将取有细菌的接种环由斜面底部向上划一直线，再由下至上在斜面上作曲线划线。（3）试管口灭菌后加塞，接种环烧灼灭菌后放回原处。（4）在试管上做好标记，经35℃培养18~24h后观察结果。图4-6斜面培养基接种法5．涂布接种法本法主要用于活菌计数和药敏试验。（1）活菌计数：取一定稀释度的菌液0.1ml滴在平板上，用无菌L型玻璃棒将液滴涂布均匀，盖上平板盖，经35℃培养18~24h后计数菌落，则每毫升所含活菌数=菌落数×10×稀释倍数。（2）直接涂布法：多用于纸片法