人胰岛素得制备获得目得基因从供体细胞中提取mRNA,以其为模板,在反转录酶得作用下,反转录合成胰岛素mRNA互补DNA,再以cDNA第一链为模板,在反转录酶或DNA聚合酶I得作用在,最终合成编码它得双链DNA序列。即得到了目得基因。反转录-聚合酶链反应法(一)从人体细胞内提取胰岛素基因转录得mRNA1,细胞总RNA得提取:取胰岛B细胞,用PBS洗后,加入TRIZOL试将细胞破裂,后用DEPC处理,多次离心后,取RNA白色沉淀,测OD值,电泳。2,从总RNA中分离mRNA:取上述提取得总RNA若干,加入BufferOBB,OligotexSuspension,打匀。70℃水浴(裂解RNA得二级结构),20-30℃条件下,静置(让Oligotex与mRNA结合)。将Oligotex/mRNA复合物得沉淀加到EP管SPIN柱上高速离心,加Buffer将其她RNA洗脱,最后用琼脂糖凝胶电泳纯化mRNA。(二)mRNA转录合成cDNA第一链cone第一链得合成加入上步获得得mRNA与适当引物于EP管中,加入RNase-freewater,混匀后,70℃反应10分钟,反应完成后,立刻将反应体系置于冰上5min;稍微离心一下,顺序加入缓冲液、RNA酶抑制剂、反转录酶、dNTP(加入放射性同位素利于检验),混匀,稍微离心反应物之后,42℃放置2分钟。取出置于冰上。电泳分析,同位素活性测定。(三)PCR法扩增,特异合成目得cDNA链通过胰岛素得特异引物,用PCR法进行扩增,特异得合成胰岛素得cDNA链。PCR法得操作步骤:预变性引物退火引物延伸循环25-35次最后延伸前端引物:5’-ggttccggatctggttctggttctctggtcccccgcggtagtcaccaccaccaccaccaccgttttgtgaaccaacacctgtgcggc-3’后端引物:5’-agtgtcgacttagttgcagtagttctccagctggta-3’组建重组质粒采用pQE--30质粒作为载体,用双酶切法进行基因重组。１、双酶切法用两种酶限制性内切核酸酸消化载体DNA与外源DNA片段,使载体与外源目得基因得两端分别形成不同黏性末端,将它们混合,在连接酶得作用下相同得黏性末端可退火连接成重组DNA分子,从而实现DNA得定向连接。２、重组过程pQE--30用HindⅢ与BamHⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳分离、回收纯化酶切片段。外源DNA片段同样也用HindⅢ与BamHⅠ酶切并回收纯化酶切片段。双酶切后得载体外源DNA片段混合退火,因为HindⅢ与BamHⅠ得黏性末端不匹配,避免了载体与外源DNA片段得自身连接,外源DNA片段只能定向地连接到载体得HindⅢ与BamHⅠ位点之间。当然也不可避免发生载体得HindⅢ与BamHⅠ得黏性末端之间得两个碱基互补形成开环,转到大肠杆菌中被修复,但这样得重组子占少数,就是低效转化。三、构建基因工程菌重组人胰岛素得大肠杆菌工程菌得构建A链与B链同时表达法将人胰岛素得A链与B链编码序列拼接在一起,然后组装在大肠杆菌-半乳糖苷酶基因得下游。重组子表达出得融合蛋白经CNBr处理后,分离纯化A-B链多肽,然后再根据两条链连接处得氨基酸残基性质,采用相应得裂解方法获得A链与B链肽段,最终通过体外化学折叠制备具有活性得重组人胰岛素。重组DNA得转化1,CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞:取100ml菌体培养至OD600=0、5,离心收集菌体,用10ml冰冷得10mMCaCl2溶液悬浮菌体,离心,收集菌体,用1ml冰冷得75mMCaCl2溶液悬浮菌体,冰浴放置12-24小时,备用。2,大肠杆菌感受态细胞得质粒转化:取100ml感受态细胞,加入相当于50ng载体得重组,DNA连接液,混匀。冰浴放置半小时。在42℃保温2分钟(热脉冲),快速将转化细胞转移至冰浴中放置1–2分钟。加入1ml新鲜培养基,于37℃培养1小时(扩增)。涂在合适得固体培养基平板上进行筛选。经典得CaCl2转化方法:a将培养液转入HYPERLINK""\t"_blank"离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。b弃去上清,用预冷得0、05mol/L得CaCl2溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。c弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油得0、05mol/L得CaCl2溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。d感受态细胞分装成200μl得小份,贮存于-70℃。e从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。f加入pBS质粒DNA溶液(含量不超过50ng,体积不超过10