[实验目的]：通过超速离心分离血浆脂蛋白能够达到下列要求：掌握超速离心技术的原理。熟悉差速沉降离心法、密度梯度区带离心法中的差速区带离心法和等密度区带离心法的机理、特点及应用。了解制备性离心机分为哪几类、各自的特点及应用。了解转头、离心管有哪些？各自的特点及应用。了解梯度材料的选择原则及应用范围掌握血浆脂蛋白的分离方法。[实验原理]:本实验采用正常人抗凝血浆，以NaBr为密度介质，利用各脂蛋白颗粒密度不同，经过超速离心大量制备低密度血浆脂蛋白。离心分离技术生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒（细胞器、生物大分子的沉淀等）以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离，而沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。这项技术应用很广，诸如分离出化学反应后的沉淀物、天然的生物大分子、无机物、有机物。在生物化学以及其它的生物学领域常用来收集细胞、细胞器及生物大分子物质。1.基本原理离心力：当一个粒子（生物大分子或细胞器）在高速旋转下受到离心力作用时，此离心力“F”由下式定义，即：F=m·a=m·ω2ra—粒子旋转的加速度，m—沉降粒子的有效质ω—粒子旋转的角速度，r—粒子的旋转半径(cm)。相对离心力：常用地球引力的倍数来表示，因而称为相对离心力,RCF=m×a/m×g=a/gRCF==1.119×10－5×(rpm)2r(rpm—每分钟转数，r/min)由上可见，给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可以相互换算。若RCF值不变，一个样品可在不同的离心机上获得相同的结果。已知离心机转数为2500rpm，离心机的半径为7.7cm，将两点连接起来交于RCF标尺，此交点500×g即是RCF值。RCF(×g)=1.119×10-5×r×rpm2。2离心分类沉降速度:沉降速度是指在强大离心力作用下，单位时间内物质运动的距离。沉降时间:在实际工作中，常常遇到要求在已有的离心机上把某一种溶质从溶液中全部沉降分离出来的问题，这就必须首先知道用多大转速与多长时间可达到目的。如果转速已知，则需解决沉降时间来确定分离某粒子所需的时间。沉降系数:根据1924年Svedberg对沉降系数下的定义：颗粒在单位离心力场中粒子移动的速度。S=（1/ω2X）·（dx/dt）=d2（ρp-ρm）/18η1S=10-13秒式中,d为球形粒子直径；η为流体介质的粘度；ρp为粒子的密度；ρm为介质的密度。从该式中可看出，（1）当ρp>ρm，则S>O，粒子顺着离心方向沉降。（2）当ρp=ρm，则S=0，粒子到达某一位置后达到平衡。（3）当ρp<ρm，则S<O，粒子逆着离心方向上浮。2.1差速沉降离心法2.2密度梯度区带离心法：2.2.1差速区带离心法：不同的颗粒间存在沉降速度差时（不需要像差速沉降离心法所要求的那样大的沉降系数差）。在一定的离心力作用下，颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度介质的不同区域上形成区带的方法称为差速区带离心法。此法仅用于分离有一定沉降系数差的颗粒（20%的沉降系数差或更少）或分子量相差3倍的蛋白质，与颗粒的密度无关，大小相同，密度不同的颗粒（如线粒体，溶酶体等）不能用此法分离。离心后在近旋转轴处（r1）的介质密度最小，离旋转轴最远处（r2）介质的密度最大但最大介质密度必须小于样品中粒子的最小密度，即ρP＞ρm。2.2.2等密度离心:离心管中预先放置好梯度介质，样品加在梯度液面上，或样品预先与梯度介质溶液混合后装入离心管，通过离心形成梯度，这就是预形成梯度和离心形成梯度的等密度区带离心产生梯度的二种方式。此密度梯度包含了被分离样品中所有粒子的密度。当管底介质的密度大于粒子的密度，即ρm＞ρP时粒子上浮；在管顶处ρP＞ρm时，则粒子沉降，最后粒子进入到一个它本身的密度位置即ρP＝ρm，此时dr/dt为零，粒子不再移动，粒子形成纯组份的区带。定义：离心时，样品的不同颗粒向上浮起，一直移动到与它们的密度相等的等密度点的特定梯度位置上，形成几条不同的区带。此法一般应用于物质的大小相近，而密度差异较大时。常用的梯度液是CsCl。提高转速可缩短达到平衡的时间，离心所需时间以最小颗粒到达等密度点（即平衡点）的时间为基准，有时长达数日。四种血浆脂蛋白的比重：此次是将血浆预先与梯度介质混合后装入离心管，通过离心将整个液体形成梯度,在强大离心力作用下各脂蛋白依其自身密度不同而分散于相应的离心管中的密度梯度同一密度层，从而达到分离纯化的目的。[操作步骤]1．血浆准备：取血库血浆250mL。2．CM和VLDL分离：1）取约250ml血浆调密度至1.019g/mL，分置于离心管中，加盖，用密度1.019g/mL液平衡，放入RP50T转头，在8