《生化大实验》实验课程简介目录实验一蛋白质含量的测定考马斯亮蓝G-250存在着两种不同样色形式，红色-棕黑色和蓝色。染料与蛋白质结合后有红色-棕黑色和蓝色形式，最大光吸收由465nm变成595nm，测定595nm吸光的增加量，可以测定与其结合的蛋白质的量。蛋白质与染料结合速度很快，2min就可以反应完全，并可以稳定1h，蛋白质-染料复合物有很大的消光系数，使得测定蛋白质浓度是灵敏度很高。测定范围为10-100μg蛋白质，微量测定时达到1-10μg蛋白质。此反应反复性好精度高，线性关系好。【实验仪器及用品】6.移液管0.5ml（×2），1.0ml（×2），5ml（×1）7.分光光度计8.试管1.5cm×15cm(×8)9.量筒100ml(×1)10.电子分析天平11.试管架(×1)【实验内容及步骤】2.未知样液的测定另取一干净试管，加入样品1.0ml及考马斯亮蓝染液4.0ml，混匀，室温静置3min，于波长595nm处比色，读取吸光度。在标准曲线上查找蛋白质浓度。【注意事项】1、如果测定的要求很严格，可以在试剂加入5-20min内测定吸光度，在这段时间内样色很稳定。2、测定中，蛋白质-染料复合物会吸附在比色皿上，实验证明可以忽视。测定完后可以用乙醇洗干净。【思考题】二、紫外分光光度法测定蛋白质含量利用紫外分光光度法测定蛋白质浓度的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，因此广泛应用与蛋白质和酶的生化制备。此法的缺点是：对酪氨酸和苯丙氨酸含量差异大的蛋白质测定有一定误差。2若样品种含有嘌呤嘧啶等会出现比较大的干扰，此时必须同时测定260和280nm吸光度，通过公式校正测定，以消除核酸的影响，而推算处蛋白质浓度。不同蛋白质和核酸吸收是不同的，即使校正也存在误差，但是可以做为初步测定。该法测定蛋白质的浓度范围为0.1—1.0mg/mL。【仪器与试剂】1.紫外分光光度计，比色管（10ml的5个），吸量管。2.标准蛋白质溶液：0.9%NaCl溶液溶解0.25g结晶牛血清白蛋白，稀释到250ml。3.待测蛋白溶液：用酪蛋白配制，浓度在1.0-2.5mg/ml4.0.9%NaCl溶液5.试管1.5cm×15cm（×9）6.移液管1ml（×3），2ml（×2），5ml（×2）。【实验步骤】1、标准曲线法（1）标准曲线的制作：取8只试管按表2-5加入试剂，摇匀。选择光程1cm石英比色皿，在280nm波长测定A280，以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。（2）样品测定：配制待测蛋白质溶液1ml，加入蒸馏水3ml，摇匀，测定A280，从标准曲线中查出蛋白质浓度。2.直接测定法在紫外分光光度计上，将待测蛋白质溶液加入比色皿，以生理盐水为对照，测定280nm和260nm波长吸光度。按一下公式计算蛋白质浓度：蛋白质浓度（mg/mL）=1.45A280-0.74A260(C为蛋白质浓度，mg/ml,A280和A260分别为蛋白质溶液在280nm和260nm处测得的吸光度值)。本法适用于微量蛋白质浓度测定，对盐类混杂的情况比较合适，为简便起见，对混合蛋白质溶液，可用A280×0.75来表示蛋白质大概浓度。【注意事项】由于各种蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸含量不同，显色深浅随不同蛋白质改变，因而本法只适用于蛋白质相对浓度的测定，核酸对结果也有影响，尽管进行了公式校正，但是不同样品干扰成分差异较大，致使280nm紫外吸收法检测的准确性较差。【思考题】1.紫外分光光度法测定蛋白质浓度的原理是什么？2.影响紫外分光光度法测定准确性的因素有那些？三、Folin-酚法测定蛋白质浓度【材料、试剂、与器具】3、标准浓度牛血清蛋白溶液200μg/ml4、721分光光度计5、刻度吸管0.5ml（×1），1ml（×2），5ml（×1）6、试管1.5cmX15cm8只7、恒温水浴【操作步骤】1、标准曲线的绘制取6只试管，按下表加入试剂:加入试剂A后，混匀，室温10min，在加Folin-酚B3.0ml，混匀后10min，再第二次加0.2ml，混匀放置30min。于660nm比色，做标准曲线。2、样品测定取样品1ml按上表加试剂，660nm处比色，对照标准曲线求出蛋白质浓度。【思考题】1、Folin-酚法测定蛋白质浓度的原理是什么？2、影响Folin-酚法测定蛋白质浓度的准确性的因素有那些？四、双缩脲法【试剂和器材】1.2.0mg/mL牛血清白蛋白溶液2.容量瓶10ml（×6）3.试管1.5cm×15cm（×8）4.双缩脲试剂：溶解0.175g硫酸铜（CuSO45H2O）溶于15ml水中，在100ml容量瓶中加入30ml浓氨水、30ml冷蒸馏水和20ml饱和氢氧化钠，摇匀，室温1-2h定容100ml，摇匀备用。在搅拌下加入300ml10%氢氧化钠溶液，用水稀释