实验一HLA微量淋巴细胞毒试验微量淋巴细胞毒试验（Microcytotoxicityassay）是在经典的补体依赖的淋巴细胞毒试验（complementdependentcytotoxicity，CDC）基础上发展而来的一项实验技术，目前已经广泛应用于器官移植供、受者间的交叉配型、复发性流产的封闭抗体检测等多个领域。在器官移植的文献中提及的CDC法多指微量淋巴细胞毒法。器械微量淋巴细胞毒反应板（泰萨奇板）、倒置荧光显微镜、微量移液器、吸管、温箱、离心机、磁架等。试剂淋巴细胞分离液(Ficoll,γ＝1.077)、T/B淋巴细胞分离磁珠及洗涤液、冻干补体、荧光染色液、供者全血2~3ml（EDTA或ACD抗凝）、受者血清2ml、阴性对照血清（可用1640培养液或PBS替代）、阳性对照血清（抗全淋巴细胞抗体ALG/ATG）。淋巴细胞的分离（Ficoll法）：1.将供者全血用PBS(pH7.4)缓冲液按1:1稀释，混匀备用；2.取15ml离心管一支，加入一定体积的Ficoll液，用吸取稀释后的供者全血，沿试管壁缓慢加入，使全血置于Ficoll上层。Ficoll液与稀释后的全血体积之比为1:2；3.1500~2000rpm/min（半径15cm水平转子）离心10min；4.取出离心管，吸取中间白膜层，置于另一干净离心管中；5.加入PBS，洗涤；6.2000rpm/min离心5min，倾出上清液；7.重复步骤5、6；8.PBS液调整细胞浓度为2×109/L。淋巴细胞毒反应（一步法）1.于泰萨奇板每孔中加入5μl石蜡油，以防反应物挥发；2.建立反应格局，每位待测标本均应设立阴性对照、阳性对照；3.分别于各相应孔中加入1μl淋巴细胞（混合淋巴细胞、T淋巴细胞、淋巴细胞）、1μl待测血清以及2μl补体；4.22~25℃温度下孵育1h；5.荧光染色液染色并终止反应。结果应在染色后10分钟内观察，以防荧光猝灭。特殊情况不能立即观察时，应将反应板用避光纸包紧，置于4℃冰箱中，尽早观察结果。死亡细胞由于荧光染料进入而呈红色（染料中的EB与DNA结合），体积略为增大。活细胞因为细胞膜完整而呈明亮的绿色（染料中的CFDA与细胞膜蛋白结合），具有强折光性。根据死亡细胞占全部细胞的百分比来计分，目前普遍采用国际通用的NIH计分方法，如下表。判断死细胞的百分比需要操作者具备一定的工作经验，大致原则为：可疑2分，30为4，过半记6，强阳写8。淋巴细胞毒试验记分标准1.每份标本都必须设立阴、阳性对照；2.温度过低有可能产生假阴性结果；3.只有当阴性和阳性对照结果准确时，该实验的阳性和阴性结果方能成立。淋巴细胞毒试验是测定患者机体内是否含有特异性针对供者的淋巴细胞毒抗体，检测的是HLA特异性的IgG和IgM抗体，包括HLA-I类抗体和II类抗体。由于混合淋巴细胞中主要为T淋巴细胞，B淋巴细胞数量较少，而HLA-II类抗体在T淋巴细胞表面不表达，仅在B淋巴细胞表面表达，因而，利用混合淋巴细胞进行CDC试验时，对HLA-I类抗体阴性、II类抗体阳性的患者，易产生漏检，而造成这种结果的原因是由于混合淋巴细胞中B淋巴细胞占全部细胞的比例较少所致。为了更加真实、全面地反应患者的免疫状态，我们应该如何改善上述局限性对实验结果造成的影响？实验二群体反应性抗体检测群体反应抗体（Pannelreactiveantibody）是指存在于某些人体内的抗人类白细胞(HLA)抗体，可通过输血、输血小板、妊娠以及器官移植等免疫途径获得。PRA测定即是检测患者体内是否存在HLA抗体、抗体的水平高低以及抗体特异性如何。PRA对于患者是否发生排斥、移植物的存活状态以及器官功能的实现都有着不可忽视的作用。实验原理器械：各种移液器、吸头、温箱、离心机、微量酶标仪等。试剂：抗原微孔板（以LATmixtray为例）对照血清（10×serumcontrol）去离子水(steriledeionizedwater)酶标二抗（100×alkalinephosphatase-conjugatedanti-humanIgG)抗体稀释液（1×antibodydiluent）洗液（10×washbuffer）底物A和B（1×colorimetricenzymesubstrateA&B）反应终止液（1×stopreagent）试剂准备1.在第一次使用时，至少提前20min取出冻干对照血清以2ml去离子水轻轻摇震使其彻底溶解。将溶解后的对照血清溶液分装，每管100μl，储存在-20℃冰箱中，每次实验前取出，恢复至室温后使用；2.将洗液用去离子水(steriledeionizedwater)按1：9稀释，可根据工作频率一次性配制一定量的工作液，4℃冰箱贮存备用；3.