第四章抗生素的生物合成途径一、次级代谢的概念和特点（一）概念微生物在一定的生长时期（一般是稳定生长期），以初级代谢产物为前体，合成一些对微生物的生命活动没有明确功能的物质的过程就是次级代谢，这一过程的产物即为次级代谢物。根据生理功能分为抗生素、色素、激素、生物碱、毒素、酶抑制剂等。二、次级代谢的特点1.次级代谢以初级代谢产物为前体，并受初级代谢的调节例如糖降解产生的乙酰CoA是合成四环素、红霉素及β-胡萝卜素的前体；缬氨酸、半胱氨酸，是合成青霉素、头孢霉素的前体；色氨酸是合成麦角碱的前体等。2.次级代谢产物一般在菌体生长后期合成此类微生物的生理过程可以区分为两个阶段，即菌体生长阶段和代谢产物合成阶段。例如，链霉素、青霉素、金霉素、红霉素、杆菌肽等，都是在合成阶段形成。例如，青霉素合成中的酰基转移酶、链霉素合成中的脒基转移酶等次级代谢中的关键酶都在合成阶段被合成。一般认为是由于碳分解产物产生阻遏作用的结果，阻遏解除后，合成阶段才能开始。3.次级代谢酶的专一性低一条途径中缺失某一个酶后，该酶反应前面的物质并不积累，反应顺序后面的酶仍能起作用，产生出一个分支代谢产物。例如金霉素链霉菌（S.aureofaciens）失去氯化能力或培养基中没有氯化物存在时，不能合成金霉素。但用于合成金霉素的中间产物，仍可进行氨基化、甲基化反应，进而合成四环素。4．次级代谢产物合成酶是初级代谢物诱导产生的初级代谢物可诱导合成酶的产生从而增加最终产物的产量。在放线菌发酵过程起诱导作用的是由内源代谢物如A因子。A因子既可诱导灰色链霉菌和比基尼链霉菌（Streptomycsbikiniensis）的形态分化，又诱导其化学分化．并且促进气生菌丝、分生孢子、链霉素合成酶以及链霉素的形成。在灰色链霉菌中，A因子能在转录水平上诱导至少10种蛋白质，其中之一是链霉素—6—磷酸转移酶，这种酶具有两种功能：其一是参与链霉素的生物合成；其二是与抗性有关。5.次级代谢产物的合成不具有菌株特异性产生菌的分类地位和其所产生的次级物质之间没有相关性，分类地位相同的菌可以产生不同的抗生素，分类地位不同的菌，可以产生相同的抗生素。不过一种次级代谢产物只有相对较少的几种微生物能够合成，并且一种微生物产生的几种次级代谢产物通常是一组结构相关的物质。6.次级代谢与质粒的关系吖啶黄插入质粒DNA双链碱基对之间，造成碱基对增加或减少，高温则使质粒变性。它们使原来产生抗生素的质粒不能复制，从而影响抗生素的产生，说明了质粒控制着抗生素的合成。从春日霉素和金丝霉素产生菌春日链霉菌的体内分离出质粒，经电镜观察有三种不同长度（15μm、3.4μm和0.59μm）的DNA。含有15μmDNA的质粒控制春日霉素的合成；含有3.4μmDNA的质粒，控制金丝霉素合成。三、抗生素生物合成的研究方法与次级代谢产物的多样性不同，微生物生物合成次级代谢产物的生化反应可以归纳为数目有限的若干条生物合成途径。论证生物合成途径的一般步骤为：①确定构成目的产物的构建单位即生源；②确定生物合成途径中的关键的中间产物，合理地推断反应顺序；③分离鉴别生物合成反应中的关键酶。由于生物合成过程中初级代谢和次级代谢两种途径相互交叉，影响因素很多，因此生物合成机理的研究较为困难。常用的研究方法有以下几种：（1）喂养实验法：在发酵的培养基中，加人某些可能是前体的物质，观察该物质在发酵过程中的利用情况与促进目的产物生成的效果。（2）洗涤菌丝悬浮法或称静息细胞法（restingcells）：取不同生长阶段的菌丝，先洗去沾染的原培养基成分和代谢产物，然后将菌丝悬浮于人工培养系统内，在一定条件下继续观察被试验的化合物对菌体代谢和对产物生物合成的影响。（3）阻断变株法（blockstrains）：将次级代谢产物产生菌进行诱变处理，筛选出失去产生某种目的代谢产物能力的突变株，即生物合成的阻断变株。这种阻断变株能够积累某种中间代谢产物或支路代谢产物，通过分离、提纯、鉴别中间代谢产物，并与目的代谢产物的化学结构相比较，推断出目的代谢产物的生物合成的反应步骤，然后再分离其反应中的特殊酶类，进一步判断其生化反应的特性。（4）互补共合成法：应用两株生物合成阻断变株，当它们单独培养时均不能产生目的代谢产物，而将它们进行混合培养时获得目的产物或者以后某一步中间体。通过分别提取、分离和鉴别阻断变株积累的中间体和共合成的产物，了解它们的阻断部位和顺序以及反应过程，推断目的产物的生物合成途径。（5）同位素标记：将具有放射性同位素3H或者14C标记的可疑前体物质加人到次级代谢产物产生菌的培养基中，培养结束后，提取分离目的代谢产物，测定结合到次级代谢产物的同位素含量和分布情况，可以判断试验化合物是否参与代谢产物的生物合成。（6）无细胞抽提液：用适当的方法从细胞中分离纯化制得纯酶。将