细胞生物学研究方法细胞生物学一、光学显微镜技术(一)普通光学显微镜1、结构:①照明系统:光源和聚光器②光学放大系统:物镜和目镜③机械装置:用于固定材料和观察方便双筒显微镜单筒显微镜2、原理:经物镜形成倒立实像,再经目镜进一步放大成像。3、几个概念:①放大(率)倍数:显微镜最后形成得物体放大像与被检物体得大小比例,即像高比物高。②分辨力(resolvingpower):指显微镜(或人得眼睛距目标25cm处)能分辨物体最小间隔得能力。③数值孔径(镜口率)(NumericAperture):NA=ｎsin(α/2)光学显微镜得分辨力R=0、61λ/N、A、其中λ为入射光线波长;N、A、为镜口率＝ｎsin(α/2);n=介质折射率;α=镜口角(样品对物镜镜口得张角)。表一、几种介质得折射率4、显微镜得几个光学特点(二)相差显微镜(phase-contrastmicroscope,PCM)由P、Zernike于1932年发明,并因此获1953年诺贝尔物理奖。这种显微镜最大得特点就是可以观察未经染色得标本和活细胞。利用物体不同结构成分之间得折射率和厚度得差别,把通过物体不同部分得光程差转变为振幅(光强度)得差别。P31在构造上,相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处:1、环形光阑(annulardiaphragm)位于光源与聚光器之间,作用就是使透过聚光器得光线形成空心光锥,焦聚到标本上。2、相位板(annularphaseplate)在物镜中加了涂有氟化镁得相位板,可将直射光或衍射光得相位推迟1/4λ环状光阑装在聚光镜得下方,而与聚光镜组合为一体——相衬聚光镜。她就是由大小不同得环形光阑装在一圆盘内,外面标有10X、20X、40X、100X等字样,与相对应倍数得物镜配合使用。12原理图:微分干涉显微镜Differentialinterferencecontrastmicroscope(DIC)②照明方式通常为落射式,即光源通过物镜投射于样品上③有两个特殊得滤光片,激发光滤片用以滤除可见光,目镜和物镜之间得阻断滤片用于滤除紫外线,用以保护人目荧光显微镜照片(微管呈绿色、DNA蓝色)(四)、激光扫描共焦显微境激光扫描共焦显微镜得特点:用激光作扫描光源,逐点、逐行、逐面快速扫描成像,能显示细胞样品得立体结构分辨率大约就是普通光学显微镜得3倍用途类似荧光显微镜,但能扫描不同层次,形成立体图像扫描得激光与荧光收集共用一个物镜,物镜得焦点即扫描激光得聚焦点,也就是瞬时成像得物点LCSM照片,蓝色为细胞核,绿色为微管(五)暗视野显微镜(六)倒置显微镜倒置显微镜inversemicroscope二、电子显微镜技术(electronmicroscope)(一)、透射电子显微镜(transmissionelectronmicroscope,TEM)1932年Ruska发明原理:(电子显微镜与光学显微镜得成像原理基本一样)用电子束作光源,用电磁场作透镜,电子束得波长与发射电子束得电压平方根成反比,也就就是说电压越高波长越短、分辨率0、2nm,放大倍数为数百万倍、用于观察超微结构(ultrastructure),及小于0、2μm,光镜下无法看清得结构、3、制样技术:1)超薄切片技术:步骤:P36莱卡超薄切片机内质网透射电镜图2)负染技术3)冰冻蚀刻(freeze-etching):标本置于-100度得干冰或-196度得液氮中,进行快速冰冻。用冷刀骤然将标本断开升温,冰在真空条件下迅即升华,暴露出断面结构-蚀刻向断面以45度角喷涂一层蒸汽铂,再以90度角喷涂一层碳,加强反差和强度。然后用次氯酸钠溶液消化样品,把碳和铂得膜剥下来,此膜即为复膜(replica)。复膜显示出了标本蚀刻面得形态,在电镜下得到得影像即代表标本中细胞断裂面处得结构。冰冻断裂与冰冻蚀刻技术(二)、扫描电子显微镜(scanningelectronmicroscope,SEM)20世纪60年代问世,用来观察标本得表面结构、用一束极细得电子束扫描样品,在样品表面激发出次级电子,次级电子得多少与电子束入射角有关,也就就是说与样品得表面结构有关,次级电子由探测体收集,并在那里被闪烁器转变为光信号,再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束得强度,显示出与电子束同步得扫描图像。图像为立体形象,反映了标本得表面结构。为了使标本表面发射出次级电子,标本在固定、脱水后,要喷涂上一层重金属微粒,重金属在电子束得轰击下发出次级电子信号。(三)、扫描隧道显微镜(scanningtunnelingmicroscope,STM)由Binnig等1981年发明,就是一种探测微观世界物质表面形貌得仪器、根据量子力学原理中得