2024凝胶过滤层析结合液相色谱一串联质谱法测定血清中游离甲状腺激素基于凝胶过滤层析(GFC)进行前处理，结合液相色谱-串联质谱(1C-MS/MS)建立了血清中游离三碘甲腺原氨酸(FT3)和游离甲状腺素(FT4)的高通量、高灵敏检测新方法。选用Sephadex1H-20凝胶小柱对150μ1血清样本进行过滤分离，先用Tris-HCI缓冲液(0.1mo1∕1,pH7.4)淋洗去除结合蛋白的甲状腺激素，然后用甲醇对游离的甲状腺激素进行洗脱，采用1C-MS/MS法进行检测和定量，并进行方法学验证。结果显示：FT3和FT4的线性相关系数(⑵均不小于0.9995,批内及批间相对标准偏差为18%~10%,准确度为85.4%-110%z基质效应为85.8%-114%z回收率为85.8%~107%o采用该方法与平衡透析法(ED)同时检测了95份血清样本，使用IBMSPSSStatistics26和MedCaIc统计软件(v.20.0.0)对检测结果进行配对t检验分析、PaSSingBab1ok回归分析和B1and-AItman一致性分析。结果表明，GFC∕1C-MS/MS与ED∕1C-MS∕MS法对血清中FT3、FT4的测定结果无统计学差异(P>0∙05).所建立的方法快速、简便，受干扰因素相对较少，便于临床推广，可为临床实验室游离甲状腺激素的快速、高效、准确检测提供参考方法，同时为其它游离激素的检测提供了一种新的思路。三碘甲腺原氨酸(Triiodothyronine,T3)和甲状腺素(Thyroxine,T4)是两种主要的甲状腺激素，其分泌量的增多或减少均可导致甲状腺功能障碍，并可增加心血管疾病、糖尿病并发症和妊娠并发症的发生风险。正常情况下，T3、T4分别约99.7%和99.97%与特异的血浆蛋白相结合，仅有0.3%和0.03%，为游离状态简称为FT3和FT4o而游离激素假说认为，甲状腺激素的游离形式才是其活性部分，与生物效应密切相关。FT3和FT4的测定不受血清结合蛋白的影响，是甲状腺功能体外实验的灵敏指标，可作为甲亢、甲减、甲状腺肿、重症感染发热等疾病的辅助诊断。由于血清中FT3和FT4临床检测的重要性，50多年来研究者们相继开发了测定FT3和FT4的不同方法。但由于游离甲状腺激素的浓度极低,FT3的血液浓度为1.4~6.0pg/m1,FT4为8.0~20.0pg∕m1o并且结合态与游离态之间的内源性平衡易受到扰乱，使得其检测结果的重复性、稳定性较差。因此，临床上准确检测游离甲状腺激素仍然十分困难，极具挑战性。目前，临床实验室通常通过免疫分析方法或物理分离方法检测FT3或FT4o通过免疫法间接测定的FT3、FT4含量易因其动态平衡被破坏而有误。尤其是在妊娠期，由于其结合蛋白的显著变化和嗜异性抗体的存在，使得免疫测定结果不准确。美国甲状腺协会建议，在妊娠期测定FT4的最佳检测方法为液相色谱-串联质谱(1C-MS/MS)法。该法分析灵敏度高、特异性好，已成为国外检测人血清中FT3sFT4的金标准方法。在结合态与游离态之间的内源性平衡受干扰最小的情况下，从血清中分离出FT3和FT4是该方法前处理环节的关键。经过多年的发展与改进，平衡透析和超滤已成为较为成熟和完善的物理分离技术，然而这两种方法均因其自身的局限性，尚未推广到大多数临床实验室。凝胶过滤层析（GFC）,利用分子筛作用和选择性洗脱，可以实现蛋白结合态和游离态的快速分离，加之凝胶载体的惰性高、吸附力弱，能够减小对内源性平衡的干扰。1979年，Rome11i等将凝胶过滤层析用于游离甲状腺激素测定，证实了该方法不会显著改变血清中的游离激素水平。在此基础上，本研究拟采用GFC技术，通过进一步优化，减少样本量，简化操作步骤，建立可靠的快速前处理方法，实现高通量样本检测，使其适用于临床检测实验室。在此基础上，基于1C-MS/MS技术建立高灵敏检测方法，以实现临床游离甲状腺激素的高灵敏、稳定、快速检测，为甲状腺激素临床相关疾病的诊断、预防、治疗、预后和监测等提供支撑。1实验部分1.1仪器与装置1CMS-8050C1岛津液相色谱三重四极杆质谱仪（日本Shimadzu公司）；PCWJ-IO超纯水机（成都品成科技有限公司）；涡旋混匀仪（金坛区白塔新宝仪器厂）；QB-800296孔板混匀仪（海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；BT25S型十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）;BCY960296孔正压装置、BCN960296孔氮吹仪（深圳逗点生物技术有限公司）；FiveEasyP1usFE28