凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。—般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的SephadexG-25柱的洗脱效果。对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论。1．类分离的分离效果。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用SephadexG-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用SephadexG-15凝胶。2．分级分离第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1／3。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用SephadexG-200分离血清蛋白质的效果要比SephadexG-150为好。但也有人选用G-150，那是因为G-200强度太低不便操作的缘故（见下图）。凝胶颗粒大小一般分为粗、中、细和超细四类。颗粒越细，分离效果越好，因为它容易达到平衡，但流速慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱层析中，使用干颗粒直径在70μm左右较合适。对于在水中保存的凝胶如琼脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定，效果较好。葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形式保存，使用前需用水或洗脱缓冲液充分溶账。在室温下让其充分溶账胀达到平衡，通常需要较长时间。较快的做法是将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。（二）装柱新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过柱床。（三）加样样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，但过少的样品量不但会造成设备和器材的浪费，降低工作效率，还会造成样品稀释。加样时应尽量减少样品的稀释，及凝胶床面的搅动。这一点在分级分离时尤为重要，应严格按一定的操作程序进行，通常有下列三种方法：1．直接将样品加到层析床表面为了防止柱床体积的变化，造成流速降低及重复性下降。整个洗脱过程中始终保持一定的操作压，并不超限是很必要的。流速不宜过快且要稳定。冼脱液的成分也不应改变，以防凝胶颗粒的涨缩引起柱床体积变化或流速改变。在许多情况下可以用水作洗脱剂，但为了防止非特异吸附，避免一些蛋白质在纯水中难以溶解（析出沉淀），以及蛋白质稳定性等问题的发生，常采用缓冲盐溶液进行洗脱。离子浓度至少0.02mol/L方可获得较好的结果，因为凝胶含有少量羧基，会吸附少量阳离子而排斥少量阴离子。洗脱用盐等介质应比较容易除去才好，通常，氨水、醋酸、甲酸铵等易发挥的物质用得较多。对一些吸附较强的物质也可采用水和有机溶剂（如水-甲醇，水-丙酮等）的混合物进行洗脱。洗脱剂的流速对分离效果也有很大影响，下图显示了同一凝胶柱在不同流速下的洗脱曲线。可见较快的流速下得到的冼脱峰也宽。流速低洗脱峰窄而高。也就是说，流速较低，分辨率较高，样品稀释较轻。第一个峰大约在9-10管（MW67000）洗脱时的流速与操作压有关，与凝胶的型号和粒度也有关，在同样的操作压下洗脱时往往编号小的葡聚糖凝胶，以及颗粒粗的凝胶流速大；编号大的，粒度细的流速慢。对于某种凝胶来说，在一定范围内，操作压加大，流速加快。对强度较大的凝胶，如SephadexG-10～50，在相当大的柱压范围内流速（Ⅴ）与操作压（F）成正比，与柱长（L）成反比：而对于强度差的凝胶，符合以上公式压力范围很小。进一步加大压力时，由于凝胶颗粒变形流速反而降低．常见的几种葡聚糖凝胶柱床承受压力与洗脱流速的关系见下图。欲达到流速恒定的目的，可自制恒压加液装置（下图），更可靠的是使用微量恒流泵。（五）凝胶的再生和保养葡萄糖凝胶和琼脂糖凝胶都是碳水化合物，能被微生物（如细菌和霉菌）分解。聚丙烯酰胺凝胶本身不被微生物作用，但微生物还是能在此凝胶液中和凝胶床上生长，这样会破坏凝胶的特性，影响分离效果。为防止细菌生长和发酵，可用0.02％叠氮化钠、0.05%三氯叔丁醇（仅在弱酸有效，也适用于其他离子交换剂）或0.002％洗必泰、0.01