第四章基因在大肠杆菌、酵母中的高效的表达前言基因表达是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。基因工程主要目标之一是生产常规方法难以生产的大量蛋白质产物—即实现基因的高效表达。基因高效表达研究是指外源基因在某种细胞中的表达活动，即剪切下外源基因片段，拼接到另一个基因表达体系中，使其能获得原生物活性又可高产的表达产物。基因的表达系统与表达策略一、最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。二、宿主细胞的选择（一）适合目的基因表达的宿主细胞的要求:1、容易获得较高浓度的细胞；2、能利用易得廉价原料；3、不致病、不产生内毒素；4、发热量低、需氧低、适当的发酵温度和细胞形态；5、容易进行代谢调控；6、容易进行DNA重组技术操作；7、产物的产量、产率高，8、产物容易提取纯化。（二）宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。②有各类菌株和载体系列。③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。④易培养，成本低。缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。④其内毒素很难除去。酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。三、根据表达蛋白用途选择基因的表达策略1.生物化学和分子生物学研究2.表达蛋白质用作抗原3.结构研究真核基因表达的特点一条成熟的mRNA只能翻译成一条多肽，不存在象原核生物那样的多基因操纵子模式；基因转录调节区很大，而且往往远离启动子达几百个甚至上千个碱基，它们并不直接影响RNA聚合酶与启动子区的结合，而是通过改变基因5’上游区DNA的构型来影响RNA聚合酶与启动子区的结合；mRNA合成后穿过核膜进入细胞质中后才进行翻译工作，而且通常都有复杂的成熟和剪接过程；基因的启动子区和原核基因差异很大，而且有增强子序列存在。原核体系中表达真核基因的困难细菌的RNA聚合酶不识别真核基因的启动子；真核基因转录的mRNA在原核细胞中不能结合到核糖体上；真核基因一般含有内含子，而原核细胞没有象真核细胞那样的转录后加工系统，所以mRNA中的内含子部分不能被切除，不能形成成熟的RNA，也就不能表达出有功能的真核蛋白；表达的真核蛋白在原核细胞中很不稳定，容易被细菌蛋白酶降解破坏。四、构建表达载体的策略⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。基因在大肠杆菌中的高效表达一、大肠杆菌表达载体的成份⑴启动子要求是：①强启动子②是诱导性的，如热诱导和化学诱导。⑵转录终止子使转录终止，增强mRNA的稳定性，提高蛋白质产物的表达水平。尤其是将两个终止子串联，转录终止功能更强。⑶核糖体结合位点在转录起始位点下游的一段DNA序列（SD，5’AGGAGG3’）(4)筛选标记基因(5)密码子的选择二、常见的大肠杆菌表达系统①T7表达系统T7噬菌RNA聚合酶能选择性的激活T7噬菌体启动子的转录，其mRNA合成速率相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。②Lac表达系统是β-半乳糖苷酶编码基因LacZ的转录的调控序列，该启动子可以被IPTG诱导，所以在培养基中加入该安慰诱导物就可以诱导目的基因的表达。③Tac表达系统是一种由Lac和Trp启动子杂合而成的启动子，其强度得到了很大的提高，也可被IPTG诱导表达。④λPL表达系统是负责λDNA分子转录的启动子之一，是一种极强的启动子。三、影响克隆基因表达效率的因素一般而言，所用启动子的强度、DNA的转录起始序列、密码子的选择、mRNA的二级结构、转录的终止、基因的拷贝数等都会在一定程度上影响到转基因的表达。1.启动子的结构对表达效率的影响大多