前言最佳的基因表达体系：⑴目的基因的表达产量高;⑵表达产物稳定;⑶生物活性高;⑷表达产物容易分离纯化。宿主细胞的选择二、宿主细胞分为两大类：1、原核细胞：常用有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、链霉菌等；2、真核细胞：常用有酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞等。大肠杆菌目前仍是基因工程研究中采用最多的原核表达体系。优越性：①对大肠杆菌的基础生物学、分子遗传学等背景知识和基因表达的调控机理已有了深刻了解。②有各类菌株和载体系列。③目前以实现多种基因的高效表达。表达基因产物形式多样:细胞内不溶性表达(包含体)、细胞内可溶性表达、细胞周质表达等。④易培养，成本低。缺点：①大肠杆菌中的表达不存在信号肽，产品多为胞内产物，提取困难。②因分泌能力不足，真核蛋白质常形成不溶性的包含体，表达产物需经变性复性才恢复活性。③蛋白质不能糖基化。产物蛋白质N端多余一个蛋氨酸残基。④其内毒素很难除去。酵母酵母菌是研究基因表达最有效的单细胞真核微生物。其基因组小，世代时间短，有单倍体双倍体两种形式，繁殖迅速，无毒性。能外分泌，产物可糖基化。已有不少真核基因成功表达。基因表达的基本过程基因表达的基本过程Transcription(转录):makinganRNAcopyofaDNAsequence.RNApolymeraseopensthepartoftheDNAtobetranscribed.OnlyonestrandofDNA(thetemplatestrand,antisensestrand)istranscribed.启动子（promoter）：在基因序列中，标志着转录起始的可被RNA聚合酶识别的位点(DNA区段)，一般位于基因的上游。终止子（terminator）：位于基因的编码序列之外（一般在下游）的一段标志着转录停止的RNA聚合酶识别位点。正确翻译的基本条件基因表达的基本过程根据表达蛋白用途选择基因的表达策略真核基因表达的特点原核体系中表达真核基因的困难⑴将真核基因克隆到一个强大的原核启动子和SD序列的下游，使得真核基因处于原核调控体系中。⑵采用真核基因的cDNA序列作为构建表达载体的目的基因，这样就解决了原核细胞没有RNA剪接功能的问题。⑶构建载体时，将真核基因插在几个原核密码子的后面，翻译后就得到了原核多肽和真核多肽的融合蛋白，这样就可以避免被原核蛋白酶的识别和降解，最后可以将融合多肽切除。第二节克隆基因在大肠杆菌中的表达大肠杆菌表达载体的成份常见的大肠杆菌表达系统影响克隆基因表达效率的因素b.翻译起始序列对表达效率的影响mRNA的有效翻译依赖于核糖体和其的稳定结合，大肠杆菌的mRNA序列中，核糖体的结合位点是起始密码子AUG和其上游的SD序列。所谓SD序列就是由Shine-Dalgarno首先提出的一种位于位于起始密码子上游的一段保守序列，为细菌核糖体有效结合和翻译起始所必需。一般SD序列的长度约为3-9bp，位于起始密码子上游3-11碱基的位置，它与16S核糖体RNA的3‘端互补，控制了翻译的起始。c.启动子与克隆基因间的距离对基因表达的影响研究表明启动子和目的基因间的距离对基因的表达效率影响很大，所以在构建新的表达载体时要考虑到这一因素的影响。另外，在克隆基因的末端要就近插入有效的终止子序列，否则会导致细胞能量的大量消耗，或是形成不应有的二级结构，最终影响的目的基因的表达效率。蛋白质的融合表达蛋白质的分泌型表达蛋白质的包含体形式表达减少包含体形成的策略：1.降低重组菌的生长温度。2.添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂。如高浓度的多醇类、蔗糖或非代谢糖。3.供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧、pH值等。不过，包含体的形成有时也是有利的，不仅可以获得高表达、高纯度的蛋白质，还可避免细胞水解酶对重组蛋白的破坏。有效、理想的复性方法应具备一下几个特点：1.活性蛋白质的回收率高。2.正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离。3.折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品。4.折叠复性方法利用放大。5.复性过程耗时较少。第三节基因在酵母中的高效表达甲醇酵母表达系统甲醇酵母表达系统的优点影响目的基因在甲醇酵母中表达的因素