实验1:大肠杆菌得培养与分离一、教学要求基本要求1.进行大肠杆菌得扩增,利用液体培养基进行细菌培养得操作2.进行大肠杆菌得分离,用固体平面培养基本进行细菌得划线培养。发展要求说明大肠杆菌培养得条件与实验原理。说明二、基本内容微生物得实验室培养培养基无菌技术分离、纯化大肠杆菌培养基得配制配制培养基得原则配制培养基得方法计算→称量→溶化→调pH→分装→加棉塞→灭菌→倒平板平板划线法稀释涂布法系列稀释平板涂布1.培养基得种类与化学成份培养基得种类有很多划分标准,按物理性质分:固体培养基与液体培养基(加入琼脂多少)。液体培养基用于扩大培养与工业生产,固体培养基用于菌种分离,鉴定,计数(菌落数量)。培养基得化学成分包括水、无机盐、碳源、氮源、生长因子等。按照微生物得同化作用类型就是自养还就是异养,碳源不同,自养微生物为无机碳源,如硝化细菌就是二氧化碳或碳酸盐,异养微生物为有机碳源,如大肠杆菌就是葡萄糖等有机物。2.常见微生物类群原核生物(如细菌大肠杆菌――二分裂、革兰氏阴性、异养兼性厌氧性肠道杆菌、蓝藻、支原体、衣原体、放线菌等)、原生生物(草履虫、变形虫等)、真菌(酵母菌――出芽生殖、异养兼性厌氧性微生物、霉菌、食用菌)、病毒等。细菌就是单细胞得原核生物,有细胞壁(肽聚糖)、细胞膜、细胞质,无成型得细胞核,只有一环状DNA分子(拟核)。以分裂(二分裂)得方式繁殖,分裂速度很快。用革兰氏染色法将细菌分为革兰氏阳性菌(革兰氏染液染色后,再脱色处理,细菌仍保留染色液得颜色)与革兰氏阴性菌两大类,区别在细胞壁得成分不同。大肠杆菌就是革兰氏阴性(细胞壁薄,有荚膜)、兼性厌氧得肠道杆菌。3.无菌技术对实验操作空间、操作者得衣着与手进行清洁与消毒;将培养器皿、接种用具与培养基等器具进行灭菌;为避免周围微生物污染,实验操作应在酒精灯火焰附近旁进行;避免已灭菌处理得材料用具与周围物品相接触。比较理化因素得作用强度消灭微生物得数量芽孢与孢子能否被消灭消毒较为温与部分生活状态得微生物不能灭菌强烈全部微生物能灭菌方法:①接种环、接种针、试管口等使用灼烧灭菌法。②玻璃器皿、金属用具等使用干热灭菌法,所用器械就是干热灭菌箱。③培养基、无菌水等使用高压蒸汽灭菌法,所用器械就是高压蒸汽灭菌锅。④表面灭菌与空气灭菌等使用紫外线灭菌法,所用器械就是紫外灯。4.培养基得配制原则目得要明确:根据培养得微生物种类、培养得目得等确定培养基得类型与配制量。营养要协调:培养基中各种营养物质得浓度与比例要适宜。pH要适宜:细菌培养基pH中性或偏碱性,霉菌培养基呈酸性。5.实验操作步骤(1)配制培养基:计算→称量→溶化→调pH→分装→加棉塞→灭菌→倒平板(形成斜面就是为增大接种面积)。我们一般用LB液体培养基来扩大培养大肠杆菌,培养后可在LB固体培养基上划线分离。以下为本实验中培养基配置步骤:①称量:准确称取各成分。蛋白胨0、5g,酵母提取物0、25g,氯化钠0、5g,加水50ml。配置LB固体培养基时还需加1g琼脂。②溶化:加热熔化,用蒸馏水定容到50mL。配置LB固体培养基时还需加琼脂,整个过程不断用玻棒搅拌,目得就是防止琼脂糊底而导致烧杯破裂。③调pH:用1mol/LNaOH溶液调节pH至偏碱性。④灭菌:在两个250ml得三角瓶中分别装入50mlLB液体培养基与50mlLB固体培养基,加上棉塞。将培养皿用牛皮纸包好,放入灭菌锅内,1kg压力灭菌15min。⑤倒平板:灭菌后,待固体培养基冷却至60℃左右时在酒精灯火焰附近操作进行。其过程就是:①将灭过菌得培养皿放在火焰旁,右手拿装有培养基得三角瓶,左手拔出棉塞;②右手拿三角瓶,使三角瓶得瓶口迅速通过火焰;③用左手将培养皿打开一条稍大于三角瓶口得缝隙,右手将培养基倒入培养皿,立刻盖上皿盖;④待平板冷却凝固后,将平板倒过来放置。倒过来放置得目得就是防止培养基冷却过程中形成得水滴落到培养基表面。向培养皿中转移已灭菌得培养基时,也不要把培养基沾在皿壁上。否则,空气中杂菌会在这些粘附培养基上繁殖,并污染皿内培养基。(2)接种微生物接种得最常用方法就是平板划线法与稀释涂布法。平板划线法(方法简单,考试得主要考查点):通过接种环在琼脂固体培养基表面连续划线得操作,将聚集得菌种逐步稀释分散到培养基表面(也就是分离纯化得方法)。在第一次划线后都从上次划线末端开始得目得就是获得由单个细菌形成得标准菌落。稀释涂布平板法(操作复杂,单菌落更易分开):将菌液进行一系列梯度稀释,并将不同稀释度菌液分别涂布到琼脂固体培养基上进行培养。当稀释倍数足够高时,即可获得单个细菌形成得标准菌落。1.划线分离法:用接种环蘸菌液后在含有固体培养基得培养皿平板上划