会计学第一节基因工程基础（三）基因工程的研究内容/二、基因工程的工具酶基因工程的关键技术之一就是先将目的基因DNA从供体生物体中分离出来，再与合适载体DNA连接重组等，这些分子操作涉及多种不同的酶。主要包括：限制性内切核酸酶DNA甲基化酶、DNA聚合酶依赖于DNA的RNA聚合酶连接酶激酶磷酸酶核酸酶（一）限制性内切核酸酶与DNA甲基化酶1、定义restrictionendonuclease：指一类能够识别和切割双链DNA分子内核苷酸序列的内切核酸酶DNAmethylase：是指一类能够识别DNA特定序列，并在其特定碱基的特定位置上引入甲基而发生修饰作用的酶2、限制性酶（甲基化酶）的命名和分类(1)限制酶(甲基化酶)的命名其命名主要是参照H．O．Smith和D.Nathans提出的待命名酶的供体微生物的属名与种名相结合的原则进行的，具体如下：①以属名的第一个字母(大写)和种名的最前两个字母(小写)组成的三字母符号为其基本形式如：来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)的酶用Eco表示；来源于流感嗜血菌(Haemophilusinfluenzae)的用Hin表示②当同属不同种的两种微生物的种名前两个字母完全相同时，则来自后一种微生物的酶的符号改用其种名词头前缀后第一个字母(小写)代替上述三字母符号中的最后一个字母如：来自Haemophilusparainfluenzae(副流感嗜血杆菌)的用Hpa表示，．而来自同一属的Haemophilusparahaemolyticus(副溶血嗜血杆菌)的则用Hph表示。③当微生物具有特殊名称时，则将代表该特殊名称的符号置于上述三字母符号之后如：来自Haemophilusinfluenzae的Rd株的用Hind表示；来自Haemophilusinfluenzae的Rf型的用Hinf表示。④当不止一种限制酶(甲基化酶)分离纯化自同一微生物株系时，则依其被分离的先后顺序以罗马数字(大写)置于上述命名符号之后如：来自Haemophilusaegytius的三种酶分别用HaeI、HaeⅡ和HaeⅢ表示；来自Haemophilusinfluenzae的Rd株的三种酶分别用HindI、HindⅡ和HindⅢ表示。⑤为了区别起见，在上述命名名称之前加R．表示限制酶类；在上述命名名称之前加M．表示甲基化酶类如：来自Haemophilusinfluenzae的Rd株的第三种限制性内切核酸酶为R.HindⅢ，其相应的DNA甲基化酶则为M.HindⅢ。(2)限制酶的分类根据酶的性质，可将限制酶分为三个类型:I型:三种不同亚基组成；辅助因子为ATP、Mg2+及S-腺苷甲硫氨酸其切割位点距其识别位点至少1000bp；且切割作用是随机的Ⅱ型:两个相同亚基组成；辅助因子仅为Mg2+；其识别位点常具旋转对称性；其切割位点与其识别位点重叠或在其附近；且切割作用特异性强Ⅲ型:两种不同亚基组成；辅助因子为ATP和Mg2+，也受S-腺苷甲硫氨酸激活，但并非必需；其切割位点一般在距其识别位点3’端24～26bp处PstI5’-CTGCA↓G-3’3’-G↑ACGTC-5’HpaI5’-GTT↓AAC-3’3’-CAA↑TTG-5’(3)Ⅱ型限制性内切核酸酶的基本特性①识别序列与切割位点Ⅱ型限制性内切核酸酶可识别长度为4～7bp的双链DNA特定序列，该识别序列(识别位点)常呈旋转对称性②切割方式平齐末端、5’—磷酸端2～5个核苷酸突出单链黏性末端、3’-羟基端2～5个核苷酸突出单链黏性末端③同裂酶与同尾酶isoschizomer：在Ⅱ型限制性内切核酸酶中，来源不同而识别序列和切割方式均相同者如：HpaⅡ和MspI两者的识别序列都是CCGG，切割方式也相同，因此二者为同裂酶isocaudamer：来源及识别序列不同，但DNA经其切割后能形成相同黏性末端者如：BamHI、BclI、BglⅡ、MboI、Sau3AI及XhoⅡ切割DNA后都形成相同的GATC四核苷酸突出单链黏性末端，因此其为一组同尾酶需要指出的是，由同尾酶切割DNA所得到的黏性末端可以彼此连接起来，但是不能重新切开，即原来同尾酶的识别序列都已不再存在。④限制性片段长度与切割频率经限制性内切核酸酶切割后产生的DNA片段称为限制性片段(restrictionfragment)。一般不同限制酶切割DNA后所形成的限制性片段长度不一假设在某DNA分子中，A或T出现的频率为X，G或C出现的频率为Y，那么某限制酶在该DNA分子上的切割位点出现频率(切割频率或位点频率)F可用下式表示：F=XnYm式中：n——该限制酶识别序列中双链A=T碱基对的数目；m——该限制酶